Función del mecanismo de doble diana en la regulación de proteínas periféricas de membrana

Resumen

OBJETIVOS: - Caracterización del tratamiento basado en la inhibición de la expresión de PKCalfa en combinación con hiperforina para el cáncer de mama. - Caracterización del tratamiento basado en la inhibición de la expresión de PKCalfa en combinación con salinomicina para el cáncer de mama. - Validación del análisis del perfil diferencial de transcritos de células de cáncer de mama con inhibición de la expresión de PKCalfa. - Diseño y estudio del efecto de una terapia combinada basada en la disminución de la expresión de PKCalfa combinada con fármacos inhibidores de las proteínas sobre-expresadas como consecuencia. - Determinación de rutas de señalización directamente fosforiladas por PKCalfa en la línea de cáncer de mama MCF-7. - Caracterización de la interacción de Rabfilina3A con SNAP25 en células PC12. MATERIALES Y MÉTODOS: Las diferentes técnicas usadas han sido: 1) Construcción de plásmidos de expresión, 2) Cultivos celulares (MCF-7, MDA-MB-231, PC12), 3) Microscopía confocal y TEM, 4) Ensayos de proliferación, migración y apoptosis, 5) qPCR, 6) Ensayo de ligación por proximidad (PLA), 7) Resonancia de plasmón de superficie, 8) siRNA de interferencia, 9) Inmunofluorescencia, 10) Western-blot, 11) Análisis de imagen (FIJI), 12) Estudio del perfil de fosforilación de quinasas humano. RESULTADOS: Se ha determinado el efecto anti-proliferativo y pro-apoptótico de la hiperforina en las células MDA-MB-231 en presencia y ausencia de PKCalfa. Solamente la inhibición de PKCalfa reduce un 20% la capacidad de proliferación de estas células. El tratamiento combinado de hiperforina e inhibición de PKCalfa consiguen un mejor efecto a una concentración más baja de hiperforina que los obtenidos en presencia de PKCalfa. Se ha estudiado el efecto de la salinomicina junto con la inhibición de PKCalfa sobre la capacidad de proliferación y la inducción de procesos como la autofagia y apoptosis, en dos líneas celulares modelo del cáncer de mama como son MCF-7 y MDA-MB-231. Se observó una completa reducción de la capacidad proliferativa con una concentración de 10 mM salinomicina en ambas líneas en presencia y ausencia de PKCalfa. Se ha validado el estudio del perfil génico mediante qPCR y se ha diseñado una terapia combinada que inhibe la expresión de PKCalfa y otro de estos genes simultáneamente PLCbeta4, PRKA, ERBB4 o PDGFR. Se ha medido la capacidad proliferativa, de migración y la inducción de apoptosis. Los resultados mostraron que el inhibidor BMS 599626 específico para ErbB puede tener un efecto sinérgico con PKCalfa para tratar el cáncer de mama. Otro aspecto estudiado fue el perfil de fosforilación de quinasas y sus proteínas sustrato que fue esencial para comprender como las células MCF-7 respondían con su entorno a la inhibición de la expresión de PKCalfa. Se observó una reducción general de los niveles de fosforilación relativos a la situación control, en la familia de proteínas STAT o mTOR entre otras. Nuestro grupo ha resuelto la estructura cristalina del complejo C2B de rabfilina con SNAP25 y el complejo C2B-PIP2 en colaboración con el grupo de Dr. Verdaguer IBMB-CSIC, Barcelona. Se ha llevado a cabo la caracterización biofísica y bioquímica en nuestro laboratorio, determinando que el alfa-hélice del C2B de rabfilina3A es crucial para interaccionar con SNAP25, mientras que la región polibásica es esencial para la interacción dependiente de los fosfoinosítidos con la membrana plasmática. La interacción de rabfilina3A y SNAP25 fue visualizada y caracterizada con resolución de molécula única en un ensayo de ligación por proximidad in situ (PLA) mediante la expresión transiente de HA-rabfilina3A y myc-SNAP25 en las células PC12. Otro aspecto estudiado fue el papel del C2AB-rabfilina3A en la fusión de membranas dependiente de PIP2 y calcio mediante tinción negativa en vesículas unilamelares pequeñas (POPC/POPS/PIP2) visualizadas con microscopía electrónica de transmisión (TEM). CONCLUSIONES: 1. Se ha demostrado el efecto anti-proliferativo, pro-apoptótico y pro-autofágico de la hiperforina en células de cáncer de mama MDA-MB-231. 2. La inhibición de la expresión de PKCalfa en combinación con el tratamiento de hiperforina consigue alcanzar una reducción total de la capacidad proliferativa de las células MDA-MB-231 3. La salinomicina es capaz de inhibir la capacidad proliferativa, incrementar los niveles de apoptosis y de síntesis de proteínas marcadoras de autofagia como es LC3B en las líneas celulares de mama MCF-7 y MDA-MB-231. 4. Los efectos de salinomicina sobre estas células pueden ser mejorados cuando se inhibe la expresión de PKCalfa, pudiendo bajar la dosis empleada de salinomicina y por tanto la toxicidad del tratamiento. 5. Se ha validado mediante qPCR el silenciamiento de PKCalfa mediante siRNA en las células MCF-7, así como la sub-expresión de los genes EGFR e ITGB6 apoyando así los resultados obtenidos por el microarray. 6. El uso de inhibidores específicos de las proteínas (PLCbeta4, PKA, ErbB4 y PDGFR), cuyos genes habían resultado sobre-expresados en el microarray debido a la ausencia de PKCalfa, confirmaron nuestra hipótesis de un posible efecto sinérgico en la capacidad proliferativa, de migración y apoptosis cuando se combina con la inhibición de la expresión de PKCalfa. 7. El silenciamiento de PKCalfa provoca una disminución general en los niveles de fosforilación relativa a diferentes familias de quinasas estudiadas: la familia proteínas STAT, la quinasa de adhesión focal (FAK), mTOR, HSP60, PRAS40 y dos aumentos de los niveles de fosforilación que son ERK1/2 y p53. 8. Se confirmaron los residuos implicados en la interacción de rabfilina3A con SNAP25. Los residuos de rabfilina3A se encuentran en el alfa-hélice del dominio C2B y son K651A/K656A/K663A/H617A y los residuos de SNAP25 son E38A/D41A/R45A y están en el extremo N-terminal. Esto se determinó mediante ensayos de ligación por proximidad (PLA) en células PC12. 9. También se confirmó que la interacción de rabfilina3A y SNAP25 es un mecanismo dependiente de la unión a PIP2 a través del tándem C2AB de rabfilina mediante la misma técnica de PLA. 10. Se caracterizó in vitro la interacción mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR) permitiendo calcular la constante de disociación KD = 1 µM. 11. Además, se demostró que el C2AB de rabfilina3A tiene efecto sobre la curvatura y fusión de membranas lipídicas (SUV) dependiente de la unión a PIP2 y a Ca2+ mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).