Development, validation and in vitro applications of novel 3D models to study gamete interaction in mammals

Resumen

No todos los mecanismos moleculares implicados en la interacción entre gametos son conocidos en detalle a pesar de que este proceso ha sido ampliamente estudiado. El entendimiento en profundidad de este proceso en especies como bovino o porcino es escaso. Es por ello que es necesario desarrollar nuevas estrategias reproducibles y escalables para elucidar los mecanismos moleculares del reconocimiento entre gametos para poder mejorar las técnicas de reproducción asistida y desarrollar contraceptivos no hormonales. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue desarrollar y validar una nueva herramienta in vitro para estudiar la interacción entre gametos y predecir la capacidad fecundante de una muestra seminal. El modelo tridimensional desarrollado y extensamente estudiado durante esta Tesis se basa en la conjugación de proteínas recombinantes potencialmente implicadas en la fecundación a microesferas magnéticas de sefarosa. En el capítulo 1, el modelo basado en microesferas (B) recubiertas con proteínas individuales recombinantes de la zona pelúcida (ZP) porcina (BZP) que imita la forma del ovocito fue generado, validado y caracterizado mediante SDS-PAGE, inmunotransferencia y microscopía electrónica y confocal. Las BZP imitan los complejos cúmulo-ovocito manteniendo una forma esférica además de permitir la unión de células del cumulus oophorus y presentando una superficie proteica. La conclusión del primer capítulo es que el modelo (BZP) es estable en el tiempo, permite la unión tanto de células del cumulus oophorus como de espermatozoides y proporciona una herramienta valiosa para explorar las bases moleculares del reconocimiento entre gametos en la especie porcina. En el capítulo 2, se profundiza en la aplicación del modelo como herramienta para el estudio del rol de proteínas individuales en la interacción entre gametos. Los resultados tras las distintas incubaciones del modelo con espermatozoides muestran que el 60 % de las microesferas presentan al menos un espermatozoide unido, siendo el modelo BZP2 el que presenta un mayor número de espermatozoides por microesfera y un mayor porcentaje de espermatozoides unidos que han sufrido la reacción acrosómica. Además, los modelos BZP3 y BZP4 presentan un mayor número de restos acrosomales en su superficie y un mayor porcentaje de espermatozoides no unidos a las microesferas reaccionados. El rendimiento de la fecundación in vitro (FIV) aumentó al inseminar ovocitos porcinos en presencia de BZP2. La conclusión de este segundo capítulo es que las glicoproteínas ZP3 y ZP4 están implicadas en la inducción de la reacción acrosómica mientras que ZP2 está involucrada en la unión de los espermatozoides a la ZP en la especie porcina. Por otra parte, el modelo BZP2 puede ser una herramienta útil para mejorar la eficiencia de la FIV en cerdo. Tras estudiar el rol de las glicoproteínas de la ZP de manera individual en el capítulo 2 con el modelo desarrollado en el capítulo 1, en el capítulo 3, el modelo es testeado en la especie bovina. Éste se basa en microesferas recubiertas por la proteína recombinante bovina JUNO (BJUNO) fue desarrollado y validado. Los resultados muestran que BJUNO es estable en el tiempo y los espermatozoides de toro se unen de manera específica al mismo. Además, el modelo responde de diferente manera según sea incubado con espermatozoides de distinta fuente (eyaculado vs epididimario) o con distinta capacidad fecundante (toros de alta o baja capacidad fecundante). El número de espermatozoides unidos fue mayor en aquellas microesferas incubadas con espermatozoides eyaculados y de alta capacidad fecundante respectivamente. En conclusión, se documenta un ensayo de unión de espermatozoides innovador y válido para predecir la fertilidad en mamíferos. Finalmente, estos modelos pueden ser herramientas valiosas, fácilmente desarrollables en diferentes especies, escalables y reproducibles, siendo potencialmente transferibles a la industria.