Estudio funcional de los espermatozoides que responden a los quimioatrayentes fluido folicular, fluido oviductal, medio condicionado y progesterona en la especie porcina

Resumen

En mamíferos, el encuentro espermatozoide-ovocito no es un evento que ocurra al azar, sino que los espermatozoides deben ser guiados hasta el gameto femenino (Eisenbach & Giojalas, 2006). La quimiotaxis, el movimiento del espermatozoide hacia el ovocito guiado por un gradiente de concentración de atrayentes químicos, es una técnica que se viene utilizando cada vez más en estudios de espermatozoides in vitro. El uso de biofluidos procedentes de la hembra como quimioatrayentes, es una buena alternativa para seleccionar y estudiar espermatozoides aptos para la fecundación. Las hipótesis que nos planteamos en este trabajo fueron que los biofluidos reproductivos [fluido folicular (FF), fluido oviductal (FO), medio condicionado (MC) y progesterona (P4)] en la especie porcina tienen efectos quimiotácticos y son dependientes de la concentración. Además, la selección de espermatozoides por parte de los biofluidos modifica las características bioquímicas y funcionales de los espermatozoides, por lo que mejoran la calidad embrionaria tras la fecundación in vitro (FIV). Los principales objetivos de esta tesis fueron i) Determinar la capacidad quimiotáctica y concentración optima de los biofluidos (FF, FO, MC) sobre espermatozoides porcinos. ii) Realizar un estudio comparativo de las características funcionales y bioquímicas de los espermatozoides que responden o no a factores quimiotácticos. iii) Analizar componentes en los biofluidos responsables de la actividad quimiotáctica y iv) Determinar si existe relación entre la calidad embrionaria y los espermatozoides que respondieron al quimioatrayente FF. En la primera experiencia se determinó la concentración optima de los biofluidos reproductivos (FF, FO, MC) que mayor número de espermatozoides seleccionaban después 20 min de quimiotaxis estableciendo una curva de dilución en forma de campana. Las concentraciones empleadas (v/v) para establecer la curva de dilución con los diferentes biofluidos fueron: FF: 0,13%, 0,25%, 0,5%, 1% y 1,5%; FO: 0,13%, 0,25%, 0,5%, 1% y 1,5%; y MC: 0,033%, 0,065%, 0,13%, 0,25% y 0,5%. Las concentraciones de P4 empleadas como quimioatrayente control, fueron: 1, 2,5, 5, 7,5 y 10 pM. Además, se incluyó un grupo (?) compuesto por la suma de los tres biofluidos (FF + FO + MC) para comprobar si había o no algún efecto sinérgico entre estos compuestos. Se estudió el efecto del inhibidor NNC 55-0396, el cual bloquea los canales CatSper y reprime la entrada de calcio (Ca2+) en el espermatozoide. Además, se estudió la composición de los biofluidos reproductivos mediante la técnica de HPLC-MS/MS para determinar la presencia de algunas sustancias relacionadas con la quimiotaxis. En la segunda experiencia realizamos un estudio comparativo de la calidad seminal. Para ello, analizamos la integridad acrosomal, motilidad, test hipoosmótico, fosforilación en tirosina, FIV y fragmentación de ADN. En la tercera experiencia nos planteamos analizar la posible relación entre la selección espermática con el FF y la calidad embrionaria, analizando la producción de embriones desde la división embrionaria a las 48h hasta el estadio de blastocisto expandido a las 168h. Los resultados obtenidos en la presente tesis doctoral muestran que los biofluidos reproductivos (FF, FO y MC) en la especie porcina, tienen efectos quimiotácticos y son dependientes de la concentración, presentan mejores características funcionales cuando se someten a una condición hipoosmótica. Además, únicamente los espermatozoides seleccionados con el FF incrementan la tasa de penetración y mejora la velocidad de desarrollo del embrión así como la calidad embrionaria.