Melanocortin 1 Receptor as regulator of protective responses against oxidative stress and UVR-induced DNA damage

Résumé

El gen receptor de melanocortinas 1 (MC1R) se expresa en los melanocitos y codifica para un receptor acoplado a proteínas G (GPCR) activado por MSH. Es un gen de susceptibilidad a melanoma que regula la cantidad y el tipo de pigmento melánico formado por los melanocitos epidérmicos. En respuesta a la radiación ultravioleta (RUV), el principal factor etiológico del melanoma, el MC1R silvestre protege contra la melanomagenesis mediante una combinación de mecanismos dependientes e independientes de la pigmentación. El componente dependiente de la pigmentación de la acción protectora del MC1R viene determinado por un cambio de la feomelanogénesis basal a la eumelanogénesis. La eumelanina es un pigmento fotoprotector debido a su capacidad de absorber RUV y de eliminar radicales libres. Por el contrario, la feomelanina es fotosensibilizante al promover la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y reducir el pool de antioxidantes intracelular. En cuanto a las acciones no pigmentarias, el MC1R silvestre activa enzimas antioxidantes y vías de reparación de ADN. Estos procesos parecen depender de la vía del AMPc y son desencadenados por activación del MC1R silvestre para mantener la estabilidad genómica. Por tanto, la eficiente respuesta de los melanocitos a la RUV depende de la actividad del MC1R. Sin embargo, el papel de las variantes de splicing intergénico y las variantes RHC (red hair color) de tipo "R" asociadas a cáncer de piel, cuyas propiedades funcionales en la regulación de esta respuesta están poco definidas, requiere mayor investigación. El gen que codifica para el MC1R humano presenta un sitio de poly(A) ineficiente dando lugar a proceso de splicing intergénico con su gen vecino aguas abajo Tubulin-?-III (TUBB3). Se han descrito dos MC1R-TUBB3 quimeras denominadas Iso1 e Iso2 que contienen la secuencia completa del MC1R fusionada con las extensiones en C-terminal derivadas de TUBB3, con marco de lectura correcto para Iso1 y alterado para Iso2. La exposición a la RUV promueve un cambio en la expresión de isoformas del MC1R canónico (MC1R-001) hacia las quimeras MC1R-TUBB3, lo que podría dar lugar a nuevos fenotipos necesarios para el bronceado. Para analizar su función, expresamos las isoformas intergénicas marcadas con el epítopo Flag en células heterólogas HEK293T y células de melanoma humano para su caracterización funcional. Iso1 se expresó con el tamaño esperado mientras que Iso2 dio lugar a un doblete de peso molecular significativamente menor al previsto, y presentó baja estabilidad intracelular. Iso1 e Iso2 unieron agonista marcado radiactivamente con la misma afinidad que el MC1R-001, pero su expresión en la membrana plasmática fue reducida. La disminución en la expresión en superficie celular resultó de un tráfico anterógrado aberrante más que de altas tasas de endocitosis. El acoplamiento funcional de ambas isoformas a la vía de señalización por AMPc fue menor que para el MC1R-001, pero la activación de las ERK tras unión a MSH no se vió alterada, lo que sugiere una señalización desequilibrada de las variantes de splicing. En este sentido, estas isoformas presentan un comportamiento similar con muchos alelos de variantes naturales de MC1R asociadas con un fenotipo RHC y con un riesgo incrementado de cáncer de piel. La heterodimerización de las isoformas de splicing con MC1R-001 diferencialmente marcadas y analizadas por co-immunoprecipitación fue eficiente y causó una disminución de los sitios de unión en superficie celular. Por tanto, la inducción de las quimeras MC1R-TUBB3 por la RUV podría contribuir a afinar la respuesta de bronceado al modular la disponibilidad de MC1R y sus parámetros funcionales. Las variantes RHC para MC1R promueven la producción de feomelaninas fotosensibilizantes en oposición a las eumelaninas fotoprotectoras. El MC1R silvestre activa mecanismos de reparación de ADN y defensas antioxidantes de manera dependiente de AMPc. Ya que las variantes de MC1R asociadas a melanoma presentan acoplamiento reducido a la vía de señalización por AMPc se ha postulado que estas acciones no pigmentarias serían defectuosas en células de melanoma humano y melanocitos epidérmicos portadores de variantes de MC1R, en consonancia con una mayor carga mutacional en melanomas con MC1R variante. Comparamos la inducción de enzimas antioxidantes y las respuestas de daño al ADN en células melanocíticas de genotipo definido para MC1R. Además, analizamos la maquinaria enzimática y las vías de señalización responsables de estas acciones protectoras aguas abajo del MC1R. El incremento de expresión de los genes catalasa y superóxido dismutasa tras activación del MC1R fue dependiente de AMPc y requirió MC1R silvestre. Por el contario, el pretratamiento de células melanocíticas con un agonista de MC1R antes de un tratamiento oxidativo con Luperox disminuyó i) acumulación de 8-oxo-7,8-dihydroguanina (8-oxodG), un producto mayoritario del daño oxidativo en ADN, ii) fosforilación de la histona H2AX, un marcador de rotura de doble hebra de ADN y iii) acumulación de rotura de cadena de ADN estimada por ensayos cometa. La reparación de las lesiones oxidativas dependió de la inducción de dos enzimas clave de la vía de reparación por escisión de bases (BER), OGG y APE-1/Ref1, aguas abajo de MC1R. Estas respuestas fueron comparables en células portadoras de MC1R silvestre o células con variantes MC1R sin señalización detectable por la vía del AMPc. En células melanocíticas con genotipo variante para MC1R, las respuestas protectoras de ADN fueron mediadas por AKT vía estimulación de NOX. Por el contrario, en células con MC1R silvestre, el incremento de AMPc aguas abajo de MC1R abolió la activación de AKT, posiblemente por el bloqueo de la producción de ROS intracelular mediada por NOX y fue responsable de inducir las enzimas BER y la reparación de ADN. Por tanto, la activación de MC1R podría promover reparación de lesiones oxidativas en ADN por un mecanismo dependiente de AMPc aguas abajo del receptor silvestre o vía AKT en células con genotipo variante para MC1R. Además, en células con MC1R silvestre, el AMPc induciría eficientemente las enzimas antioxidantes, principalmente catalasa, y las enzimas BER OGG y APE-1/Ref1 mientras que variantes de MC1R aumentarían eficazmente la expresión de las dos enzimas clave de BER pero no parecen tener efecto en los niveles o actividad de catalasa.