Effects of assisted reproductive technologies and reproductive fluids on phenotypical and epigenetics modifications in bos taurus oocytes, preimplantational embryos and offspring

Resumen

La infertilidad humana es una enfermedad que ha crecido exponencialmente en los últimos años. Las técnicas de reproducción asistida (TRA) son la solución para muchos problemas de fertilidad tanto en la especie humana como en el mundo animal. Pero, los datos sobre las consecuencias de las TRA no están siendo generados a la misma velocidad a la que se implementan los nuevos procedimientos. El objetivo de esta tesis doctoral consistió en estudiar el efecto de diferentes TRA y de los protocolos utilizados, cubriendo desde el ovocito hasta la descendencia. En el Capítulo 1, se presenta una breve revisión de la literatura, donde se aborda el problema de la infertilidad tanto en humanos como en animales, así como la historia del desarrollo de las TRA, los protocolos más utilizados actualmente, y, por fin, los problemas que han sido asociados a esas mismas TRA. El Capítulo 2 resume las hipótesis y objetivos de la tesis doctoral, mientras que el Capítulo 3 incluye el estudio de una de las TRA más utilizadas: la estimulación ovárica controlada (EOC). Nuestra hipótesis sería que el metiloma de los ovocitos sometidos a tratamiento hormonal estaría alterado. Se obtuvieron ovocitos de vacas no-estimuladas a partir de folículos pre-ovulatorios y, posteriormente, los mismos animales fueran estimulados hormonalmente para obtener nuevamente sus ovocitos. Utilizando tecnología de secuenciación masiva, obtuvimos el metiloma individual de los ovocitos y los resultados demostraron que, aunque el metiloma de los ovocitos no-estimulados y estimulados es globalmente muy parecido, existen diferencias específicas en la metilación de islas CpG de determinados genes de impronta y en sus regiones de control. El Capítulo 4 se ha enfocado al estudio de protocolos de maduración in vitro. Nos planteamos como hipótesis que al añadir el medio natural en el que madura el ovocito (fluido folicular) al medio de cultivo in vitro se incrementaría la competencia del ovocito para dar lugar a un embrión sano. Los ovocitos fueron madurados in vitro utilizando como suplemento fluido folicular bovino (bFF), fluido folicular bovino inactivado por el calor (bFFin) y suero fetal bovino (FBS). Los resultados demostraron los ovocitos de bFF tuvieran una mayor expansión del cumulus oophorus en comparación con los restantes grupos. Tras la fecundación in vitro, el grupo bFFin demostró una menor eficiencia, pero el porcentaje de blastocistos fueron similares entre grupos. Los embriones de los dos grupos experimentales se desarrollaron más rápidamente que los embriones del grupo FBS y presentaron mayor número de células totales. Sin embargo, la mayor calidad embrionaria no fue decisiva a la hora de evaluar la supervivencia pos-vitrificación En el Capítulo 5, embriones producidos in vitro utilizando medios de cultivo embrionario mejorados con la adición de fluidos reproductivos (RF), así como embriones control (con adición de albumina sérica bovina, BSA) fueron obtenidos para nuestros experimentos. Estos embriones fueron vitrificados y almacenados hasta su desvitrificación y transferencia a hembras receptoras sincronizadas. Paralelamente, se estableció un grupo de vacas inseminadas artificialmente (AI) utilizando el mismo toro que había sido utilizado para generar los embriones in vitro (grupos IVP). Las concentraciones hormonales de las receptoras fueron seguidas durante toda la gestación, con la intención de detectar posibles diferencias. Estas diferencias fueron más frecuentes entre los grupos BSA y AI, mientras que el grupo RF obtuvo valores intermedios. Sin embargo, se observó una mayor tendencia a la aparición de problemas en el parto en los grupos IVP así como la mortalidad neonatal ocurrió solo en los grupos IVP. En el Capítulo 6 estudiamos los terneros obtenidos según describimos en el Capítulo 5 y evaluamos su crecimiento y parámetros hematológicos durante los 30 primeros días de vida. Solo una diferencia de crecimiento fue constante durante el estudio: la altura a la cruz del grupo AI fue siempre superior a los grupos IVP. Los parámetros hematológicos demostraran algunas diferencias aisladas en algunos días, pero esas mismas no se repetían en distintos días. Sin embargo, todos los valores obtenidos se encontraban dentro de los rangos normales esperables para esa edad. Queda aún por entender si estos terneros tendrán alguna diferencia en el desarrollo posterior, ya que podrá ser muy temprano para llegar a conclusiones. Adicionalmente, se realizaron biopsias a estos mismos terneros para detectar algún cambio en el estadio de impronta de algunos genes asociados a síndromes de sobrecrecimiento. En conclusión, esta tesis demuestra que las TRA están muy lejos de ser el perfecto sustituto a la producción de embriones, desarrollo y nacimiento in vivo. El uso de estimulación hormonal, ampliamente implementado en las clínicas de fertilidad, puede ser la razón de muchas de las alteraciones encontradas en descendencia producida in vivo. La suplementación del medio de maduración puede también ser el punto clave para cambiar la calidad embrionaria in vitro. La descendencia derivada de la producción de embriones in vitro puede tener más dificultades en el parto, pero es muy similar a sus controles in vivo después del nacimiento hasta el primer mes de vida. Es evidente que se necesitan cambios en los protocolos utilizados actualmente y deben realizarse más estudios para entender los efectos de las TRA en la descendencia futura.