Purificacion y caracterizacion de la acido aminociclopropano carboxilico n-malonil transferasa en vigna radiata

Resumen

EN EL PRESENTE TRABAJO SE HA LLEVADO A CABO LA PURIFICACION A HOMOGENEIDAD DE LA MALONIL ACC TRANSFERASA OBTENIDA DE HIPOCOTILOS DE VIGNA RADIATA. ESTA ENZIMA CATALIZA LA CONVERSION DE 1-AMINOCICLOPROPANO CARBOXILICO, ACC (PRECURSOR DEL ETILENO, HORMONA VEGETAL QUE REGULA MUCHOS ASPECTOS DEL CRECIMIENTO Y DESARROLLO DE LAS PLANTAS) EN MALONILACC. SE HA ENSAYADO LA IDONEIDAD DE DIVERSAS TECNICAS ESCOGIENDOSE FINALMENTE, EL SIGUIENTE PROCEDIMIENTO: PRECIPITACION FRACCIONADA CON SULFATO AMONICO (30-70%) Y CROMATOGRAFIA SOBRE LAS COLUMNAS: PHENYL SEPHAROSE, HIDROXIAPATITO, SUPEROSE 12 Y MONOQ. LA ULTIMA ETAPA CONSISTIO EN UNA CROMATOGRAFIA ELECTROFORETICA (HPEC). TAMBIEN SE HA REALIZADO UN ESTUDIO DE LAS DIVERSAS CARACTERISTICAS BIOQUIMICAS DE ESTA ENZIMA QUE HAN PERMITIDO DESARROLLAR UNA HIPOTESIS SOBRE EL MECANISMO DE CONVERSION DE ACC EN MACC. EL PESO MELECULAR DE LA ACC-N-MALONIL TRANSFERASA, DE ESTRUCTURA MONOMERICA, HA SIDO ESTIMADO EN 37+- 3 KDA POR ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA. LOS VALORES DE KM PARA EL ACC Y EL MALONILCOA HAN SIDO 68 UM Y 74 UM, RESPECTIVAMENTE. SE HA ENCONTRADO TAMBIEN QUE EL COENZIMA A LIBRE, PRODUCTO DE LA REACCION, ES UN INHIBIDOR NO COMPETITIVO CON RESPECTO A MALONILCOA. TAMBIEN SE HA COMPROBADO QUE LA ENZIMA PUEDE UTILIZAR SUCCINILCOA COMO DADOR DEL GRUPO ACILO EN LUGAR DE MALONILCOA. TAMBIEN SE HA VERIFICADO QUE LOS D-ENANTIOMEROS DE AMINOACIDOS NO POLARES INHIBEN LA MALONIZACION DEL ACC. POR ULTIMO, SE HA REALIZADO LA SECUENCIACION DE ALGUNOS DE LOS PEPTIDOS QUE SE OBTIENEN COMO RESULTADO DE LA HIDROLISIS ENZIMATICA DE LA MALONIL TRANSFERASA. EL CONOCIMIENTO DE PARTE DE SU SECUENCIA HA PERMITIDO VERIFICAR QUE NO PRESENTA HOMOLOGIA CON NINGUNA OTRA ENZIMA PURIFICADA HASTA LA FECHA.