Nuevas aportaciones sobre el amiloide a sérico porcino

Resumen

En el presente trabajo se realizaron cinco experiencias con el fin de realizar nuevos aportes al conocimiento del Amiloide A Sérico (SAA) en la especie porcina. En la primera experiencia se intentó obtener una solución estándar de SAA porcino mediante varios métodos. En primer lugar, se intentó purificar el SAA porcino a partir de suero mediante cromatografía de interacción hidrofóbica siguiendo distintos protocolos descritos en la bibliografía. En segundo lugar, se empleó ultracentrifugación en gradiente de densidad de iodixanol para aislar el complejo HDL-SAA sérico porcino. Ninguno de estos dos métodos resultó en la obtención de una solución de SAA puro útil para la producción de anticuerpos y desarrollo de inmunoensayos. En tercer lugar, la sobreexpresión de SAA en Escherichia coli, produjo una abundante cantidad de SAA puro soluble, idónea para su uso como inmunógeno y como estándar primario en el desarrollo de inmunoensayos. Como estándar secundario se obtuvo un suero porcino de fase aguda que sería validado frente al ensayo desarrollado para producir un calibrador de rutina. En la segunda experiencia, se produjeron anticuerpos específicos frente al SAA porcino usando el SAA recombinante como inmunógeno. Como especies donantes se emplearon conejos y gallinas ponedoras para la obtención de anticuerpos policlonales y ratas para la producción de anticuerpos monoclonales. Todos los anticuerpos producidos fueron válidos para su empleo en distintos sistemas de detección inmunológicos, como ELISA indirecto y western blot. Durante la tercera experiencia se intentó desarrollar un ensayo específico para el SAA porcino empleando los reactivos obtenidos en las dos experiencias anteriores. En primer lugar, se desarrolló un ensayo tipo sándwich basado en TR-IFMA, que no fue capaz de detectar el SAA contenido en las muestras de suero porcino. En segundo lugar, se desarrolló un ensayo ELISA competitivo empleando un anticuerpo policlonal de conejo como anticuerpo de captura y una solución de SAA recombinante marcado con biotina como analito competidor. Este ensayo fue capaz de determinar el SAA contenido en muestras de suero porcino mostró parámetros analíticos altamente satisfactorios. La validación clínica del método indicó que su empleo en la determinación de SAA porcino en muestras de suero permitía distinguir entre animales sanos y enfermos. La cuarta experiencia se centró en la aplicación del ELISA competitivo desarrollado en la experiencia 3 en condiciones de campo. Para ello, se determinó la concentración de SAA en muestras de suero porcino en tres grupos de animales distintos y se compararon, por un lado con el estado sanitario de los animales determinado por el examen ante- y post-mortem de dichos animales y por otro lado, con los valores de concentración de SAA obtenidos mediante un ensayo tipo sándwich comercial. Los resultados de esta experiencia mostraron que la determinación de SAA mediante el ensayo ELISA competitivo fue capaz de establecer el estado sanitario de los animales estudiados, hallándose diferencias relacionadas con la afección de procesos clínicos o subclínicos y con la extensión y gravedad de las lesiones. Además, la eficacia diagnóstica de este ensayo fue muy superior al ensayo comercial en términos de sensibilidad y especificidad. Por último, en la experiencia 5 se llevó a cabo un estudio de caracterización bioquímico del SAA porcino. Por un lado, se determinó la secuencia nucleotídica del SAA expresado en distintos tejidos porcinos, hallándose que el patrón de isoformas de SAA del cerdo es especial, pues predomina la expresión de la isofoma local SAA3 en todos los tejidos, en relación al resto, que son indetectables. Este hallazgo permite explicar varias particularidades relativas al SAA porcino, como la incapacidad de purificarse mediante técnicas tradicionales (en la experiencia 1) y la resistencia de esta especie al desarrollo de Amiloidosis-AA. Por otro lado, se determinó mediante un estudio