Obtención de ciruelos transgénicos resistentes a sharka y eliminación de los genes marcadores en plantas de tabaco y arabidopsis combinando el sistema cre-loxp y el gen dao1

Resumo

La sharka es la enfermedad viral más perjudicial en los frutales del género Prunus, causando enormes pérdidas económicas en los cultivos de ciruelo, albaricoquero y melocotonero. El agente etiológico de la sharka es el Plum Pox Virus (PPV) que pertenece al género potyvirus. Las dos cepas más importantes en términos de impacto económico y hortofrutícola en el continente europeo son la PPV M (¿Marcus¿) y la D (¿Dideron¿). Una posible estrategia para la obtención de resistencia a PPV en Prunus es mediante biotecnología. El problema en estas especies es la baja eficiencia en los procesos de regeneración y transformación, protocolos que además se limitan a unos pocos genotipos. En la mayoría de los métodos de transformación desarrollados en especies de Prunus se utilizan explantos procedentes de semillas. Entre ellos cabe destacar un protocolo altamente eficiente desarrollado para ciruelo europeo en el que se utilizan secciones de hipocotilo como explanto. En este trabajo se ha utilizado la construcción pBIN-h-UTR/P1, que confiere una resistencia a sharka en plantas de tabaco, para obtener, mediante la infección de hipocotilos con Agrobacterium tumefaciens, plantas de ciruelo transgénicas resistentes a sharka. Las plantas transgénicas se injertaron in vitro sobre plantas de semilla de melocotonero ¿GF305¿ infectadas con PPV para evaluar su resistencia frente a la infección viral. En las líneas evaluadas no se detectó la presencia del virus en ninguno de los injertos o las señales fueron muy débiles, desapareciendo la señal a las 32 semanas, lo que podría indicar que un mecanismo de silenciamiento génico postranscripcional de genes del virus está activado. Otro inconveniente en los protocolos de transformación es la utilización de genes marcadores. Estos genes producen un rechazo social e incluso existe una directiva europea (2001/18/CE) que regula las plantas transformadas con genes de resistencia a antibióticos, los genes marcadores más comúnmente aplicados en biotecnología vegetal. En nuestro Grupo de Investigación llevamos tiempo estudiando la utilización de genes alternativos a los que confieren resistencia a antibióticos, que confieran ventajas metabólicas a las células transformadas, permitiéndoles crecer en determinados sustratos (por ejemplo los genes pmi, ipt). También se ha trabajado con construcciones que permiten, una vez obtenidas plantas transformadas, eliminar los genes marcadores (como por ejemplo construcciones Cre-loxP o los sistemas MAT). En la presente Tesis Doctoral se ha diseñado una novedosa construcción que permite la eliminación de los genes marcadores, combinando el sistema Cre-loxP y el gen marcador de selección bifuncional dao1. Este gen (dao1) permite a las células que lo contengan metabolizar D-aminoácidos que en condiciones normales resultarían tóxicos (D-serina, D-alanina) pero, por otro lado, convierte en tóxicos otros D-aminoácidos que en condiciones normales no lo son (D-isoleucina y D-valina). El interés de esta construcción está fundamentado en el doble carácter selectivo de este gen en el sistema Cre-loxP. En la construcción Cre-loxP utilizada en este trabajo, la eliminación mediante recombinación in situ por medio de la recombinasa CRE, que reconoce las secuencias lox, está inducida químicamente por ß-estradiol. Esta nueva estrategia permitió la obtención de plantas transgénicas sin genes marcadores de selección. La eficiencia de eliminación, tras la adición de ß-estradiol, de los genes marcadores en plantas transgénicas de tabaco fue del 9,4%. Sin embargo, en Arabidopsis solo se consiguió la eliminación parcial de estos. La selección negativa con D-valina en tabaco resultó muy efectiva, permitiendo solamente el desarrollo de plantas transgénicas donde el gen dao1 había sido completamente eliminado.