Functional characterization of mast cells and histamine in the immune system of gilthead seabream (Sparus aurata L.)

Resumen

El sistema inmunitario de peces teleósteos ha sido estudiado durante décadas y, a pesar de haberse realizado importantes avances en su conocimiento, todavía hoy existen grandes lagunas, especialmente sobre la presencia y la función de las células cebadas (MCs) y la histamina. La dorada (Sparus aurata L.), pez teleósteo marino de alto valor comercial en la acuicultura mediterránea, ha sido utilizado por numerosos autores en el estudio de la respuesta inmunitaria de peces. Además, y debido al hecho de que la dorada es una especie hermafrodita, muchos estudios se han centrado en el efecto que el estrógeno sintético 17?-etinilestradiol (EE2), ampliamente distribuido en los ambientes acuáticos, ejerce sobre ella. Sin embargo, ninguno de estos estudios se ha centrado en los leucocitos peritoneales. Con estos precedentes, el objetivo de esta tesis ha sido avanzar en el conocimiento del papel de las MCs y la histamina en la respuesta inmunitaria de la dorada. En el primer capítulo desarrollamos un protocolo de aislamiento de MCs peritoneales de dorada. Utilizando gradientes de centrifugación y densidad, cultivos celulares, separación celular activada por magnetismo y anticuerpos monoclonales específicos (mAb) se obtuvieron fracciones de MCs con un 95% de pureza. Las MCs peritoneales aisladas presentan histamina, la cual es liberada utilizando el compuesto 48/80 (Co 48/80), clásico activador de células cebadas. Además, la expresión de los genes il1b e il8 se induce en estas células tras estimularlas con ADN bacteriano. Este protocolo de aislamiento de MCs permitirá avanzar en el conocimiento de la evolución de los mecanismos inflamatorios de vertebrados. En el segundo capítulo, estudiamos el efecto de la histamina y del Co 48/80 en la respuesta inmunitaria innata y adaptativa de dorada. Para ello, inyectamos vía intraperitoneal histamina o Co 48/80, solos o combinados con el patógeno Vibrio anguillarum, y se analizó su efecto en el exudado peritoneal y en el riñón cefálico. La histamina y el Co 48/80 alteran el porcentaje de leucocitos peritoneales y de riñón cefálico, incrementan la producción de ROS y alteran la producción específica de IgM contra V. anguillarum. Además, ambos compuestos reducen la expresión del gen que cifra el receptor 2 de histamina en leucocitos peritoneales. Estos resultados demuestran que aunque la administración sistémica de histamina y Co 48/80 es segura, ninguno de los dos compuestos puede ser considerado como un adyuvante eficiente en la vacunación intraperitoneal de dorada. En el tercer capítulo, produjimos y caracterizamos un mAb, GB10, que reconoce específicamente MCs de dorada. GB10 marca el 20-30% de los leucocitos peritoneales. GB10 induce rápidamente la muerte de las MCs de dorada, como demostramos mediante citometría de flujo. Ensayos in vivo, en los que GB10 será intraperitonealmente inyectado en dorada, nos ayudarán a comprender aspectos evolutivos tanto de las MCs como de la histamina. Finalmente, en el cuarto capítulo, analizamos el efecto de EE2 en la respuesta inmunitaria peritoneal de dorada. El EE2 fue administrado en la dieta de juveniles de dorada durante 76 días que fueron inyectados intraperitonealmente con hemocianina y aluminio como adyuvante al final del tratamiento y 92 días después. La administración en dieta del EE2 induce la expresión de los genes que cifran los receptores de estrógenos, el nuclear ? y el acoplado a la proteína G1. De manera interesante, la administración en dieta del EE2 indujo una respuesta inflamatoria en el exudado peritoneal que se mantuvo durante varios meses después de finalizar el tratamiento, además de modular la expresión de los genes que cifran los receptores de histamina. En conjunto, este estudio proporciona nueva información sobre la disrupción endocrina inmunitaria, centrada en los leucocitos peritoneales.