Toxicidad producida por metales en peces teleósteos. Efectos sobre la viabilidad, protección e inmunidad celular

Resumen

Toxicidad producida por metales en peces teleósteos. Efectos sobre la viabilidad, protección e inmunidad celular La presente Tesis Doctoral pretende estudiar los efectos tras la exposición a metales mediante estudios in vitro en líneas celulares y cultivos primarios procedentes de dorada (Sparus aurata) y de lubina (Dicentrarchus labrax), dos de las especies marinas más importantes en acuicultura. Concretamente, se han usado dos líneas celulares (SAF-1, línea comercial procedente de aleta de dorada; y DLB-1, una línea celular generada durante esta Tesis en nuestro laboratorio a partir de explantes de cerebro de lubina) y tres cultivos primarios (eritrocitos y leucocitos de riñón cefálico (HKLs) y de sangre (PBLs)) procedentes de dorada y lubina para evaluar los efectos citotóxicos de los metales Cd, Hg, Pb y As. Además, hemos estudiado el estrés oxidativo inducido por dichos metales, mediante evaluación de la producción de ROS y la expresión de genes relacionados con la actividad antioxidante así como la expresión génica de proteínas relacionadas con mecanismos de protección celular . Además, se han analizado los tipos de muerte celular tras la exposición a metales y por último, se han determinado los efectos que los metales pueden causar en la respuesta inmunitaria de los leucocitos de dorada y lubina. Para ello, las líneas celulares fueron expuestas a los metales y la viabilidad fue medida mediante varias técnicas colorimétricas, como son el NR, MTT, CV o LDH. En el caso de los cultivos primarios de leucocitos, usamos el fluorocromo PI y citometría de flujo ya que las poblaciones en este caso son heterogéneas (linfocitos, monocitos-macrófagos y granulocitos), y para los eritrocitos, además del PI, usamos una técnica basada en la liberación de HbO2. Para evaluar el estrés oxidativa provocado por los metales, medimos la capacidad de las células para producir H2O2 y la expresión de genes relacionados con los sistemas antioxidantes (sod, cat, gr, prx) y con la protección celular (mta, hsp) mediante PCR a tiempo real. Por otra parte, para estudiar los mecanismos de muerte celular tras la exposición a metales, evaluamos la abundancia de células en apoptosis y/o necrosis usando PI y FDA/Anexina, y estudiamos la expresión de genes involucrados en la apoptosis (bax, bcl2 o casp3) mediante PCR a tiempo real. Además, las células SAF-1 fueron analizadas mediante microscopía electrónica de barrido, y el ciclo celular fue analizado en las DLB-1. Finalmente, el efecto inmunotoxicológico de los metales sobre la fagocitosis y el estallido respiratorio (principales respuestas inmunitarias innatas celulares) y la expresión de los genes ighm, tcrb, mx, bd, hepc, il1b, phox22 y phox40 fue estudiado en los leucocitos de dorada y lubina. Como conclusión, hemos generado una línea celular de cerebro de lubina denominada DLB-1 cuyo origen parece glial. Además, la exposición a los metales Cd, Hg, As y Pb en las líneas celulares y cultivos celulares primarios de dorada y lubina produjo una reducción en la viabilidad dosis-tiempo dependiente. El MeHg resultó ser el metal más tóxico, excepto para la línea celular DLB-1, mientras que el Pb fue el menos citotóxico. Entre los cultivos celulares primarios, los eritrocitos son las células más sensibles a la exposición de metales, seguidos de los leucocitos de riñón cefálico y los leucocitos de sangre. Comparando las dos especies estudiadas, las células de lubina son más resistentes a la exposición por metales que las de dorada. Por otra parte, la exposición a metales induce los sistemas de protección celular y antioxidantes, los cuáles son incapaces de compensar la sobreproducción de ROS, desencadenando el estrés oxidativo, el cual conlleva a la muerte celular, principalmente por apoptosis. Además, la respuesta inmunitaria de los leucocitos de riñón cefálico de dorada y lubina se vio disminuida tras la exposición a metales tanto a nivel génico como funcional. Así, ambas líneas celulares y los cultivos celulares primarios de peces empleados son herramientas valiosas para estudiar los mecanismos de la toxicidad producida por metales. Además, los eritrocitos de dorada y lubina deberían ser incluidos como modelo in vitro en estudios de Toxicología. Toxicity caused by metals in teleost fish. Effects on cellular viability, protection and immunity During the present Doctoral Thesis, we have studied the in vitro effects of metals on fish cell lines or primary cell cultures derived from gilthead seabream (Sparus aurata L.) and European sea bass (Dicentrarchus labrax L.) specimens, which are two marine fish species of great importance in aquaculture. Specifically, two cell lines (commercial SAF-1 cell line, derived from the seabream fins, and DLB-1, a cell line established during this Thesis from the sea bass brain) and three primary cell culture (erythrocytes and head-kidney (HKLs) and peripheral blood (PBLs) leucocytes) from marine gilthead seabream and European sea bass specimens were exposed in vitro to Cd, Hg, Pb or As and the resulting cytotoxicity was assessed. Furthermore, we evaluated the oxidative stress, by measuring reactive oxygen species (ROS) levels and/or mRNA transcription of antioxidant enzymes, as well as proteins involved in cell protection after metal exposure. In addition, we elucidated the main cellular death mechanisms triggered by metal exposure and the immunological effects of metals on leucocytes from seabream and sea bass. For this purpose, fish cell lines were exposed to metals and the viability was measured using colorimetric techniques such as NR, MTT, CV or LDH. In the case of leucocytes we used the fluorescent dye PI and flow cytometry since we use heterogeneous populations (lymphocytes, monocyte-macrophages and granulocytes) while for erythrocytes, apart from PI, we also used another technique based on the release of the HbO2 after metal exposure. For evaluating the oxidative stress provoked by metals, the production of H2O2 and the measure of gene expression of antioxidant enzymes (sod, cat, gr, prx) or proteins involved in cell protection (mta, hsp) by real-time PCR was performed. On the other hand, to study the cell death mechanisms after metal exposure, abundance of cells in apoptosis and/or necrosis using PI and FDA/Annexin V and flow cytometry, and the expression of regulatory genes involved in apoptosis (bax, bcl2 or casp3), was evaluated. In addition, scanning electron microscopy analysis of cell morphology in SAF-1 cell line and the cell cycle analysis in DLB-1 cells was studied. Finally, immunotoxicological effects of metals on leucocytes was evaluated by the analysis of phagocytosis and respiratory burst activity (the two main innate cellular immune responses) and the transcription of ighm, tcrb, mx, bd, hepc, il1b, phox22 and phox40 genes. Taking into account our results, we conclude that a new European sea bass brain cell line, called DLB-1, which shows glial origin, rapid cell division and low transfection rate has been generated. Furthermore, exposure to metals Cd, MeHg, Pb and As resulted in a dose-dependent cytotoxicity in all the fish cells studied. MeHg produced the highest cytotoxicity, except for DLB-1 cells, while Pb was the lowest toxic metal. Among the primary cell cultures, erythrocytes show the highest cytotoxicity after metal exposure followed by head-kidney and blood leucocytes. Regarding fish species, European sea bass exhibits more resistance to metal than gilthead seabream. In addition, cellular protection and antioxidant defences are induced in fish cells after metal exposure but they are unable to compensate the ROS overproduction leading to a marked oxidative stress, which in turns induces the cellular death, mainly by apoptosis. Regarding the immune response, it is impaired in European sea bass and gilthead seabream head-kidney leucocytes after metal exposure at both gene and functional levels. Thus, both fish cell lines and primary cell cultures represent valuable tools to evaluate the mechanisms of metal toxicity. Moreover, gilthead seabream and European sea bass erythrocytes should be further used as in vitro models in Toxicological studies.