Caracterización molecular y funcional de la interleuquina-1beta de dorada (sparus aurata l.)

Résumé

Durante el desarrollo de la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo la caracterización de la interleuquina-1b (IL-1b) de dorada (Sparus aurata L.). Nuestro trabajo se ha elaborado en tres etapas. En una primera etapa se abordó la clonación del gen de la IL-1b de dorada mediante una aproximación por clonación homóloga utilizando RT-PCT. El cDNA de la IL-1b de dorada contiene 1.271 nucleótidos (nt) que incluyen un marco de lectura abierta de 762 nt, un extremo 5' no traducido (UTR) de 102 nt y un extremo 3'UTR de 407 nt. El gen está compuesto por 5 exones y 4 itrones. La secuencia posee un alto grado de homología a nivel de aminoácidos con otras IL-1b de peces (del 38% al 96%), encontrándose la mayor homología con las secuencias de sargo (Diplodus puntazzo) y de dentón (Dentex dentex), especies de la misma familia que la dorada y cuyas IL-1bs también han sido parcialmente obtenidas en el presente trabajo. El transcrito de la IL-1b se acumulan en diferentes órganos linfomieloides en peces infectados experimentalmente con la bacteria Vibrio anguillarum, así como en leucocitos y macrófagos estimulados in vitro con derivados bacterianos (LPS y DNA) y linfoquinas. En la segunda etapa del estudio, la IL-1b de dorada se expresó en Escherichia coli como una proteína de fusión a 6xHis y se purifició mediante cromatografía de afinidad a una resina de cobalto. La IL-1b purificada se utilizó como inmunógeno para obtener un anticuerpo policonal específico. La última etapa del presente trabajo se centró en el estudio de la producción y el mecanismo de liberación de la IL-1b de dorada utilizando el anticuerpo obtenido. Tanto el LBS y el DNA bacteriano como las linfoquinas fueron capaces de inducir la acumulación intracelular de un polipéptido de unos 30 kDa que represente el precursor de la IL-1b (proIL-1b). La adición de ATP no produjo el procesamiento ni la liberación de la IL-1b en las células de riñón cefá