Estudio de las propiedades de las colinesterasas en epitelios de las vías aéreas superiores humanas y sus alteraciones en el cáncer

Resumo

Objetivos Los objetivos principales de la presente Tesis Doctoral son: 1. Determinar los niveles de actividad Acetilcolinesterasa (AChE) y Butirilcolinesterasa (BChE) en epitelios sanos y tumorales de laringe. 2. Analizar los componentes de formas moleculares de las enzimas en tejidos sanos y patológicos. 3. Identificar y cuantificar los distintos transcritos de AChE y BChE, de la enzima colina-acetil transferasa (ChAT) y de distintas subunidades de los receptores nicotínicos y muscarínicos de ACh en tejidos sanos y tumorales de pacientes con cáncer. 4. Analizar si los posibles cambios en la expresión o actividad de AChE y BChE tienen relación con características clínico-patológicas de los pacientes con cáncer. 5. Desarrollar protocolos para la realización de ensayos ABPP de serina hidrolasas a través del empleo de sondas dirigidas contra el centro catalítico de moléculas activas. 6. Comprobar si la saliva es un fluido corporal dónde aparecen serina hidrolasas activas y establecer patrones de perfiles ABPP asociados con cáncer. Metodología Los métodos bioquímicos y moleculares empleados son: 1. Método de extracción secuencial de enzimas por empleo primero de de tampones de alta fuerza iónica y después con medios con detergentes. 2. Medida de actividades AChE y BChE por método espectrofotométrico de Ellman adaptado a microplacas. 3. Ensayos de gradientes para el analisis de sedimentación. 4. Inmunoensayos 5. PCR a tiempo real 6. Ensayos ABPP 7. Análisis estadístico. Para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS. Conclusiones 1. El epitelio de las vías aéreas superiores humanas expresa los componentes necesarios para establecer un sistema colinérgico fisiológicamente activo. El sistema colinérgico no neuronal de epitelios humanos se compone de proteínas que participan en la síntesis y liberación de ACh, de receptores nicotínicos y muscarínicos y de las enzimas de hidrólisis AChE y BChE. 2. Las actividades AChE y BChE descienden significativamente en los epitelios tumorales. El descenso de actividad enzimática se relaciona con parámetros clinicopatológicos y factores de riesgo como el consumo de tabaco y alcohol influyen en los niveles de actividad colinesterásica. 3. Las actividades AChE y BChE tisulares aportan información pronóstica. Las tasas de supervivencia global y de supervivencia libre de enfermedad son menores cuanto menor es la actividad AChE de tejidos patológicos, al contrario de lo que sucede con la BChE. Análisis multivariante revelan que la actividad AChE es factor pronóstico independiente. 4. Las formas moleculares de AChE presentes en los epitelios de vías aéreas superiores se limitan a formas globulares ligeras (G1A y G2A) y no se afectaron por el cáncer. Formas moleculares más complejas como formas tetraméricas (G4A) sólo aparecen en tejidos sanos de localización supraglótica que, además, están ausentes en tejidos patológicos. 5. La presencia de moléculas de AChE enzimáticamente activas, y su disminución en tumores, y de moléculas no activas, probablemente moléculas tipo AChE-T implicadas en la apoptosis, refuerzan la idea del papel de la AChE como gen supresor de tumores. 6. La expresión de genes que codifican los componentes del SCNN se altera por la exposición de los epitelios al tabaco. 7. Se propone un modelo para explicar la influencia de la señalización colinérgica en el cáncer. El modelo aporta un posible mecanismo para explicar que el riesgo de cáncer asociado al consumo de tabaco se mantenga mucho tiempo después de cesar en el hábito tabáquico. 8. El análisis de perfiles de proteínas activas (ABPP) en tejidos de vías aéreas superiores y saliva con la sonda FP-Tamra, se perfila como una nueva herramienta útil para la identificación de nuevas proteínas implicadas en la transformación neoplásica y/o de biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico del cáncer de vías aéreas superiores. Objetives The main objetives of the present Doctoral Thesis are: 1. To establish the levesof Acetylcholinesterase (AChE) and Butyrylcholinesterase (BChE) activity in human non-cancerous and cancerous larynx tissues. 2. To analize the AChE and BuChE molecular forms in human non-cancerous and cancerous larynx tissues. 3. To Identify and quantify the levels of AChE and BChE mRNA and BuChE, and the mRNA levels for nicotinic and muscarinic ACh receptors, ChAT and PRIMA in in human non-cancerous and cancerous larynx tissues. 4. To analize if changes in the gen expression or activity of AChE and BuChE have any relation with clinico- pathological parameters in cáncer patients. 5. To desing protocols for (Activity Based Protein Profile) ABPP assays with targeting serine hydrolases by using active site-directed probes. 6. To comfirm if saliva is a corporal fluid contaninig active serine hydrolases and to analize them with ABPP assays. Methodology The biochemical and molecular methods are: - Extraction with buffer and detergent. - Measurement of AChE and BChE activities for Ellman method. - Gradient assays for sedimentation analysis. - Immunoblotting. - Real Time- PCR - ABPP - Statistical analysis with SPSS software version 15.0. Conclusions 1. The human upper airway truck epithelium possesses the capacity to express a wide range of ACh related proteins, such as AChE, BuChE, nAChR, mAChR and ChAT. These and previus observations lent strong support to the presence in airway epithelium of a physiologically active non-neuronal cholinergic system. 2. The activity levels of AChE y BChE significantly decrease in HNSCC epithelium. This fact suggests a probable relationship between cancer promoting habits (smoking or alcohol intake) and pathological and clinical variables. 3. Tissue activities of AChE y BChE provide pronostic information. The lower AChE activity, the lower overall and disease free survival. The contrary was found with BuChE. Multivariate analysis showed that low AChE activity was an independent pronostic marker. 4. Molecular forms of AChE present in human upper respiratory epithelium were light globular forms (G1A y G2A) and were not afeccted by cancer. More complex molecular forms as tetrameric forms (G4A) appeared only in non-cancerous tissues of supraglottis location, and were not present in cancerous larynx tissues. 5. The presence of molecules of AChE catalytically active, his decrease in cancerous larynx tissues and non-active AChE molecules, problably apoptosis-related AChE-T subunits, reinforce the idea of AChE as a tumor suppresor gene. 6. Exposition of human upper respiratory epithelium to smoking components alters the expression of the genes that codify the componentes of non-neuronal cholinergic system. 7. A model is proposed to explain the influence of cholinergic signalling in cancer. This model provides a possible mechanism to explain the risk of cancer associate with tabaquic habit after smoking cessation for long time. 8. ABPP analysis on human upper respiratory tissues and saliva with FP-TAMRA, can be a new useful tool for identification of new proteins involved in neoplastic transformation and/or diagnostic and pronostic biomarkers in human upper respiratory epithelium with cancer.