Importancia de los transmisores gaseosos CO y SH2 en la nefropatía diabética e isquémica

Resumen

A lo largo de los años, los conocimientos sobre papel representado por los transmisores gaseosos en los distintos procesos fisiológicos, y concretamente en la regulación de la función hemodinámica renal, ha crecido exponencialmente. Estos agentes son el óxido nítrico (NO), el monóxido de carbono (CO) y más recientemente el sulfuro de hidrógeno (SH2). El óxido nítrico (NO) es sintetizado a partir de la L-arginina, por una familia de enzimas llamadas genéricamente óxido nítrico sintasas (NOS), y por sus múltiples acciones vasodilatadoras, antiagregantes, y reguladoras de la función renal, entre otras acciones, se reconoce como un transmisor fundamental para el funcionamiento normal del organismo. Su importancia es tal que la falta de su síntesis, o de sus acciones mediadoras, frecuentemente determinadas por los altos niveles de estrés oxidativo, se sitúa en el origen de muchas alteraciones vasculares y orgánicas asociadas a la hipertensión, la diabetes, o episodios de isquemia/reperfusión renal. El sistema enzimático de la hemo oxygenasa (HO) está constituido por 2 isoformas activas: hemooxigenasa-1 (HO-1) y hemooxigenasa-2 (HO-2) cuya expresión se ha documentado en estructuras vasculares y tubulares del riñón. La actividad HO cataliza la degradación oxidativa del grupo hemo, dando lugar a CO, biliverdina (BV) y bilirrubina (BR), todos ellos productos con actividad biológica. La HO-2 es la isoenzima constitutiva, mientras que, la HO-1 es la isoforma inducida en condiciones patológicas que implican estrés oxidativo como la disfunción renal que aparece en una diabetes tipo- (DM-1), una situación que cursa con una disminución de la biodisponibilidad de NO. El sulfuro de hidrógeno se sintetiza en el organismo principalmente por la acción de las enzimas cistationina ?-sintasa (CBS) y cistationina ?-liasa (CGL) que generan SH2 a partir del aminoácido L-Cisteína (L-Cis). Estudios recientes destacan los efectos protectores del SH2 en las lesiones tisulares provocadas tras una isquemia-reperfusión (IRI) renal, una de las principales causas de insuficiencia renal aguda y disfunción del trasplante renal. El objetivo general de esta Tesis Doctoral fue analizar la importancia funcional del sistema Hemooxigenasa (HO) y de la ruta biosíntética que conduce a la producción de SH2, como parte de los mecanismos que contribuyen a la regulación de la hemodinámica renal en dos modelos experimentales de disfunción renal: diabetes mellitus tipo-1 (DM-1) e isquemia/reperfusión renal. Para reproducir los cambios estructurales y funcionales de la diabetes renal, se utilizó un modelo experimental de diabetes inducida por la administración de streptozotocina (STZ) en ratas Sprague Dawley (SD), un tóxico específico de células ?-pancreáticas. Para analizar el significado funcional de la actividad HO en el riñón diabético de los animales, se empleó la mesoporfirina de estaño (SnMP; 40 µmol/kg, i.v) en animales anestesiados. La determinación de expresión de HO -1 y HO-2 se llevó a cabo mediante Western Blot. A su vez, se cuantificó por ELISA las concentraciones renales de proteínas nitrosiladas, como índice de estrés oxidativo. Las concentraciones tisulares de NO in vivo se determinaron mediante voltametría, una técnica altamente selectiva y específica. Para disminuir los niveles de estrés oxidativo se administró Tempol (1mM) en el agua de bebida, durante 12 días previos al experimento agudo. Para determinar el papel del SH2 en la IRI tisular, se utilizó un modelo de 45/60 minutos de isquemia-reperfusión renal. Se estudiaron los efectos del sulfhidrato de sodio (un donante de SH2); el sustrato enzimático L-cisteína, y los inhibidores de las enzimas CBS y CGL, ácido aminooxiacético y propargilglicina, respectivamente. Las concentraciones corticales renales de SH2 se midieron electroquímicamente. Además, se analizaron los efectos de la administración intravenosa de estas sustancias sobre la función renal, 24 horas después de una isquemia reperfusión. Los principales resultados sugieren que la expresión de HO-1, junto con la respuesta vasoconstrictora renal a la inhibición de la HO, se incrementa en ratas diabéticas notablemente hiperglucémicas que muestran bajos niveles de NO. Además, el tratamiento con Tempol en animales diabéticos, que redujo el estrés oxidativo y la expresión de la proteína HO-1, también atenuó la respuesta vascular renal a la inhibición de la HO en animales diabéticos. Por su parte, la isquemia renal produjo aumento de los niveles endógenos de SH2 en la corteza renal, aunque sólo el pretratamiento con una fuente exógena de SH2 parece contribuir a mejorar significativamente la insuficiencia renal observada 24 horas después de la reperfusión tisular. Over the years, knowledge about the role represented by gaseous transmitters in different physiological processes, and specifically in the regulation of renal hemodynamic function, has grown exponentially. These agents are nitric oxide (NO), carbon monoxide (CO) and more recently hydrogen sulfide (SH2). Nitric oxide (NO) is synthesized from L-arginine, by a family of enzymes generically called nitric oxide synthases (NOS). Because of its multiple vasodilatory, antiaggregating and regulating actions of renal function, among others, NO is recognized as a fundamental transmitter for the normal function of the organism. The lack of its synthesis, or mediating actions, often determined by the high levels of oxidative stress, represents the origin of many vascular and organic alterations associated with hypertension, diabetes, or episodes of ischemia / Renal reperfusion. The enzyme system of hemo-oxygenasa (HO) has 2 active isoforms: hemoxygenase-1 (HO-1) and hemoxygenase-2 (HO-2) whose expression has been documented in vascular and tubular kidney structures. The HO activity catalyzes the oxidative degradation of the heme group and produces CO, biliverdin (BV) and bilirubin (BR), products with biological activity. HO-2 is the constitutive isoenzyme, whereas HO-1 represents the isoform induced in pathological conditions involving oxidative stress and renal dysfunction that appears in type-1 diabetes (DM-1), a situation that occurs with a decreased NO bioavailability. Hydrogen sulphide is mainly synthesized in vivo by the action of the enzymes cystathionine ?-synthase (CBS) and cystathionin ?-lyase (CGL). That generates SH2 from the amino acid L-Cysteine (L-Cis). Recent studies highlight the protective effects of SH2 on damaged tissue after renal ischemia-reperfusion (IR), a major cause of acute renal failure and renal transplant dysfunction. The general objective of this Doctoral Thesis was to analyze the functional importance of the Hemoxygenase (HO) system and the biosynthetic pathway that leads the production of SH2, as part of the mechanisms that contribute to the regulation of renal hemodynamics in two experimental models of Renal dysfunction: type-1 diabetes mellitus (DM-1) and renal ischemia / reperfusion. To reproduce the structural and functional changes of renal diabetes, an experimental model of diabetes induced by the administration of streptozotocin (STZ), a specific ?-pancreatic cell toxin, in Sprague Dawley (SD) rats was used. To analyze the functional significance of HO activity in the diabetic kidney of animals, tin mesoporphyrin (SnMP; 40 ?mol / kg, i.v) was used in anesthetized animals. The determination of HO-1 and HO-2 expression was carried out by Western blotting. In turn, the renal constraints of nitrosylated proteins, as an oxidative stress index, were quantified by ELISA. Tissue concentrations of NO in vivo were determined by voltammetry, a highly selective and specific technique. To reduce oxidative stress levels, Tempol (1 mM) was administered to the drinking water for 12 days prior to the acute experiment. To determine the role of SH2 in tissue IRI, a 45/60 minute model of renal ischemia-reperfusion was performed. We studied the effects of sodium sulhydrate (a SH2 donor); the enzymatic substrate L-cysteine and the inhibitors of the enzymes CBS and CGL, aminooxyacetic acid and propargylglycine, respectively. The effects of sodium sulfhydrate (SH2 donor) were studied; Renal cortical concentrations of SH2 were measured electrochemically. In addition, the effects of intravenous administration of these substances on renal function were analyzed 24 hours after ischemia reperfusion. The main results suggest that HO-1 expression, as well as renal vasoconstrictor response to HO inhibition, is remarkably increased in hyperglycemic diabetic rats showing low NO levels. In addition, treatment with diazepam in diabetic animals, which reduced oxidative stress and expression of the HO-1 protein, also attenuated the renal vascular response to the inhibition of HO in diabetic animals. Renal ischemia produced increased levels of endogenous SH2 in the renal cortex, although only pretreatment with an exogenous source of SH2 seems to contribute to a significant improvement in renal insufficiency observed 24 hours after tissue reperfusion.