Estudio de la función del gen DOCK10, inducible por IL-4 en linfocitos B, como factor de intercambio de nucleótidos de guanina y de los perfiles de expresión génica y microRNA en leucemias linfocíticas crónicas tratadas con IL-4 in vitro

Resumen

En estudios previos, nuestro grupo identifico a DOCK10 como un gen cuya expresion se induce por IL-4 en linfocitos B normales (LBN) y en leucemias linfociticas cronicas (LLC). Dada su pertenencia a la familia de proteinas DOCK, se sugiere un posible papel como regulador de las GTPasas Rho. En la publicacion 1 tratamos de responder algunas preguntas esenciales sobre la funcion de DOCK10, tales como: (1) su especificidad para interaccionar con las GTPasas Rho ¿gclasicas¿h, que abordamos mediante la realizacion de ensayos ¿gpulldown¿h tras transfeccion transitoria en la linea celular 293T; (2) su papel potencial como GEF activador de estas proteinas, que tambien abordamos mediante ensayos ¿gpulldown¿h pero realizados en este caso en un sistema de clones con expresion estable e inducible generado en la linea celular HeLa; y (3) su papel en la morfologia celular, dinamica del citoesqueleto de actina y protrusiones de membrana mediante microscopia de fluorescencia en este mismo sistema. Pudimos demostrar que las isoformas de primer exon mutuamente excluyente DOCK10.1 y DOCK10.2 interaccionan in vitro de forma especifica con las GTPasas Cdc42 y Rac1 en condicion libre de carga de nucleotido y que DOCK10.1 incrementa los niveles de activacion de ambas GTPasas. DOCK10.1 induce la transicion desde una forma elongada y poligonal, hasta una forma mas redondeada, no poligonal, con incremento de filopodios y ondulaciones de membrana, cambios compatibles con la activacion de dichas GTPasas. La patogenia de la LLC es poco conocida, y la IL-4, como factor de crecimiento de los linfocitos B, podria jugar un papel. La IL-4 ejerce un papel anti-apoptotico en la LLC, y algunos estudios sugieren la hipotesis de que podria jugar un papel oncogenico. Puesto que una parte importante de la accion de la IL-4 es muy probablemente ejercida a traves de cambios inducidos en la expresion genica, y esta no ha sido suficientemente estudiada en LBN y LLC, planteamos un analisis mediante microarrays en ambos tipos celulares (publicacion 2). La IL-4 regula la expresion de al menos 229 genes, 189 en LLC y 123 en LBN, siendo 89 comunes, la mayoria inducidos, y con mayor diferencia que los genes reprimidos, y tambien mayor intensidad en LLC, sugiriendo que esta ruta es muy activa en esta patologia. La mayoria de estos genes no eran dianas conocidas de la IL-4. Ademas la respuesta genica a la IL-4 es diferente en funcion de la expresion del factor pronostico ZAP-70, a traves de un mecanismo que implica al factor de transcripcion NF¿ÈB. Tambien identificamos genes que se correlacionan con la proteccion anti-apoptotica, tales como HOMER2 y BCL6. En la publicacion 3 estudiamos mediante microarrays la respuesta a la IL-4 de un tipo de genes no convencionales denominados miRNAs, importantes en la regulacion de la expresion proteica. Identificamos 8 miRNAs maduros, miR-21 (5p y 3p), miR-362 (3p y 5p), miR-500a-3p, miR-502-3p, y miR-532 (3p y 5p), que se inducen por la IL-4 en LLC, y esto ocurre probablemente por un mecanismo ¿gpasivo¿h, siendo miR-21 intragenico a VMP1, el resto de miRNAs intragenicos a CLCN5, y ambos genes inducidos por la IL-4, de modo que los miRNAs se inducirian incrustados dentro de los transcritos primarios de ambos. Puesto que la IL-4 juega un papel crucial en la evasion de la apoptosis y la resistencia a quimioterapia, la identificacion de los genes y miRNAs regulados por la IL-4 contribuiria a un mayor esclarecimiento de los mecanismos moleculares de la senalizacion por la IL-4, lo que podria aprovecharse para buscar alternativas terapeuticas mediante la manipulacion de esta via, con inhibidores especificos o con nuevos abordajes mas experimentales como el empleo de miRNAs. In previous studies, our group identified DOCK10 as an IL-4-induced gene in normal B cells (NBC) and chronic lymphocytic leukemias (CLL). Since it belongs to DOCK family proteins, a potential role as a regulator for Rho GTPases is suggested. In publication 1, we tried to answer some essential questions about DOCK10 function, such as: (1) its specificity to interact with ¿eclassic¿f Rho GTPases, that we undertook by performing pulldown assays following transfection in 293T cell line; (2) its potential role as a GEF for ¿eclassic¿f Rho GTPases, also by means of pulldown assays but in this case by creating a HeLa cell clone system with stable regulatable expression; and (3) its role in cell morphology, actin cytoskeleton dynamics, and membrane protrusions by fluorescence microscopy in the HeLa cell clone system. We found that the mutually exclusive first exon isoforms DOCK10.1 and DOCK10.2 interact specifically with nucleotide-free Cdc42 and Rac1 in vitro, and that DOCK10.1 induces an increase in the levels of activation of both GTPases. DOCK10.1 induces a transition from an elongated polygonal shape towards a more rounded, non-polygonal shape, with increase of filopodia and membrane ruffles. These changes are consistent with activation of both GTPases. CLL pathogenesis is not well-known, and IL-4, as a B-cell growth factor, could play a role. IL-4 is anti-apoptotic in CLL, and several studies suggest that it could play an oncogenic role. Since IL-4 very likely exerts part of its effects by inducing changes in the gene expression profiles, and these have not been comprehensively studied in NBC and CLL, we performed a microarray study in both cell types (publication 2). We found that IL-4 regulates expression of at least 229 genes, 189 in CLL and 123 in NBC, being 89 common. Most of them are induced, and these suffer stronger changes. Changes are also more intense in CLL than in NBC, suggesting that the IL-4 pathway is very active in CLL. Most of the genes were not previously known as IL-4 targets. Moreover, we found that the gene response to IL-4 depends on basal expression of the prognostic marker ZAP-70, through a mechanism that involves NF¿ÈB transcription factor. We also identified genes that correlate with anti-apoptotic protection, such as HOMER2 and BCL6. In publication 3, we studied, also by microarrays, the gene response of a type of nonconventional gene called miRNAs, which are important for regulation of protein expression. We identified 8 mature miRNAs, miR-21 (5p y 3p), miR-362 (3p y 5p), miR-500a-3p, miR-502- 3p, y miR-532 (3p y 5p), that are induced by IL-4 in LLC. This occurs probably through a ¿epassive¿f mechanism, since miR-21 is intragenic to VMP1, the remaining miRNAs are intragenic to CLCN5, and both genes are induced by IL-4. Thus, the miRNAs would be induced embedded within VMP1 and CLCN5 primary transcripts. Because IL-4 play a crucial role in evasion from apoptosis and resistance to chemotherapy, identification of genes and miRNAs regulated by IL- 4 could contribute to elucidate the full picture of signalling mechanisms triggered by IL-4. This knowledge could be useful for searching new therapeutic alternatives through manipulation of this pathway with specific inhibitors or new experimental approaches such as the use of miRNAs.