Mecanismos fisiopatológicos del remodelado y la calcificación arterial en la cardiopatía isquémica

Resumen

Resumen Antecedentes. La calcificación vascular es un factor de riesgo cardiovascular independiente y frecuentemente asociado a otras condiciones clínicas como diabetes mellitus, enfermedad renal crónica, uso de anti-vitaminas K, envejecimiento y enfermedades congénitas. Es el elemento anatomopatológico de la lesión aterosclerótica tipo Vb según Stary. La tomografía coronaria computarizada (TCC) y la escala Agatston permiten la valoración cuantitativa del calcio coronario (CAC). La mineralización vascular y la diferenciación de la célula de músculo liso vascular (CMLV) hacia fenotipos osteoblásticos son características fisiopatológicas y resultan de la pérdida de inhibidores de la calcificación (proteína Gla de la matriz carboxilada, cMGP) y la hiperfosfatemia (HPM). Calumenina, un inhibidor endógeno de la gamma-carboxilación, y las enzimas prolil-lisil oxidasa y lisil oxidasa (PLOD y LOX) implicadas en el ensamblaje y entrecruzamiento del colágeno en la matriz extracelular, deben participar en el desarrollo de la calcificación vascular. Objetivos: i) Estudiar la relevancia del polimorfismo rs1043550 afectando la región 3'-UTR del gen CALU y evaluar la participación de calumenina y su regulación en el proceso de la calcificación vascular, ii) Analizar el papel de la MEC en un modelo celular de calcificación vascular en cultivos primarios de CMLV humana y de ratón, y iii) Comparar los efectos de la warfarina y el acenocumarol, sobre la mineralización y activación del programa de diferenciación osteoblástica también en CMLV. Metodología. Se reclutó pacientes ambulatorios y estables del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca (Murcia, España) para estudiar la asociación entre el SNP CALU rs1043550 y la CAC valorada mediante TCC y puntuación Agatston. Tejido arterial se embebió en parafina para estudio histológico de mineralización (tinción Alizarin Red), inmunohistoquímica para calumenina y MGP en asociación con la variante alélica de CALU. Se clonó la región 3'UTR de CALU en vectores plasmídicos pGL3 Basic conteniendo el gen LUC (p3U-CALUa) y se utilizó la mutagénesis dirigida para producir la forma polimórfica (p3U-CALUg). Los ensayos luciferasa se realizaron en células endoteliales HUVEC y CMLV. Se desarrolló un modelo in vitro de calcificación en CMLV humana durante 2-18 días basado en una HPM a base de fosfato inorgánico. Eventualmente, se utilizó CMLV de ratón (CMLVr) silvestre o transgénica para la sobreexpresión de LOX o agentes químicos específicos para inhibir las actividades PLOD y LOX/LOXL; así como dosis sub-terapéuticas de warfarina y acenocumarol para evaluar su efecto en la calcificación. Se utilizó qPCR para el estudio de los genotipos, la expresión génica de genes osteoblásticos y miRNAs. Mediante SDS-PAGE y western blot se valoró la síntesis de proteínas. El calcio depositado se recogió sobre solución ácida para valoración cuantitativa por el método de la o-cresoftaleína o se visualizó mediante tinción von Kossa. Resultados. El alelo silvestre del SNP CALU rs1043550 se asoció con CAC elevada y lesión coronaria severa. El estudio histológico también evidenció un mayor grado de calcificación residual en los tejidos de pacientes homocigóticos para el alelo silvestre, menor marcaje de calumenina y MGP. La actividad luciferasa ensayada en HUVEC y CMLV fue un 30% menor en las células transfectadas con p3U-CALUg. Ello sugiere que CALU rs1043550 es funcional y desestabiliza el mRNA CALU. Además, calumenina se sobreexpresó en las etapas tempranas de la calcificación, reprimiéndose posteriormente. Ello se asoció con un incremento progresivo de la calcificación, la represión del fenotipo CMVL (SM22- ) y la sobreexpresión y síntesis de marcadores de diferenciación osteoblástica (BMP2, RUNX2, SP7/Osterix, CTNNB1 y BGLAP/osteocalcina). La HPM se asoció, además, con la activación de vías secretoras de calumenina y su co-localización con los depósitos de calcio. El descenso de calumenina se asoció con la síntesis de osteocalcina y cMGP que sugieren la restauración de la gamma-carboxilación en las fases tardías de la calcificación. La forma carboxilada de osteocalcina es la única capaz de participar en la maduración de la matriz extracelular mineralizada. Adicionalmente, se describió una regulación de calumenina dependiente de miRNAs. Se predijo con sistemas bioinformáticos potenciales sitios de unión a 3'UTR CALU para los miR-132 y miR-218 y se evidenciaron con vectores de expresión. Ambos miRNA están reprimidos durante las etapas tempranas de la calcificación de la CMLV, coincidiendo con la sobreexpresión de CALU. Ensayos miRNA mimic sugirieron una estricta regulación de miR-218 y una regulación negativa tanto de la expresión y la síntesis de calumenina como de la expresión de BMP2, en asociación con una menor mineralización. Adicionalmente se ha demostrado que la sobreexpresión de LOX y su inhibición (BAPN) se asociaron con una inducción o inhibición de la calcificación y la diferenciación de la CMLV, respectivamente. Igualmente, la inhibición de la actividad PLOD (2,2'-dipiridil) se asoció con menores valores de calcio y diferenciación osteoblástica. La MEC debe constituir un soporte mecánico, un substrato de mineralización y debe participar en procesos de comunicación y diferenciación celular. Finalmente, la utilización de warfarina o acenocumarol resultó en una mineralización exacerbada pero mostraron diferencias en la expresión de marcadores de diferenciación en comparación con la HPM control. Acenocumarol es un buen agente para acelerar la mineralización. Como en el condroblasto hipertrófico, la sobreexpresión y síntesis de calumenina se pospuso en las CMLV tratadas con acenocumarol.