Identificación de nuevos elementos implicados en la regulación de antitrombina= Identification of new elements involved in antithrombin regulation.

Resumen

Identification of new elements involved in antithrombin regulation. Identificación de nuevos elementos implicados en la regulación de antitrombina. Mª Eugenia de la Morena Barrio Antithrombin is a key anticoagulant serpin. Any factor affecting, even moderately, the levels or function of this molecule will unbalance a finely regulated haemostatic system, increasing the risk of thrombotic disorders, as widely demonstrated with congenital antithrombin deficiency. Mutations in the coding regions of the gene encoding antithrombin, SERPINC1, have been identified in a high proportion of patients with antithrombin deficiency. However, there are few studies evaluating other elements playing a role in such a relevant molecule. Objective. To identify new genes and/or genetic modifications involved in the regulation of antithrombin levels. Methods. We have studied an interesting cohort of 29 patients with moderate or severe antithrombin deficiency without mutation in the coding region of the SERPINC1 gene. The search also involved 307 healthy controls, a family study (GAIT) and large case control studies involving 2,980 patients and 3,996 controls from different countries and diverse thrombotic diseases, as well as patients with congenital disorder of glycosylation, which is a rare disorder. To achieve our goals we have used extensive molecular methodology ranging, from simple genotyping of point mutations or polymorphisms to complex genome wide association studies, as well as sequencing of two genes (SERPINC1 and PMM2) and quantitative RT-PCR. We also used cellular biology methods, such as reporter systems, silencing assays, and immunofluorescence staining. Finally, biochemical assays were also used, from western blot analysis of multiple proteins (antithrombin, ?-antitrypsin, transferrin, prothrombin and platelet glycoproteins), to proteomic and glycomic studies. We also used HPLC and FPLC methodology. Results. This study has identified the first mutation affecting the promoter of SERPINC1 that is associated with antithrombin deficiency. This result has allowed us not only to identify new regulatory regions of this gene, but also sustains the analysis of this region in molecular studies of patients with severe or moderate antithrombin deficiency. We also confirmed the low genetic variability of SERPINC1, particularly in the coding region, probably explained by the conformational and functional sensitivity of this serpin. Moreover, we found a minor role of SERPINC1 genetic variability on the levels of this anticoagulant in healthy population. This result, together with the high heritability of this trait, sustains the existence of other genetic factors modulating antithrombin levels. Actually, our GWAS and validation studies together with further functional results have identified the first modulating gene of antithrombin. Impaired LARGE expression caused reduction of antithrombin, potentially by the intracellular role of the heparan-like molecule generated by the xylosyltransferase and glucuronyltransferase activities of this molecule, although the mechanism is still unknown. Our study has also identified global glycosylation abnormalities interfering with antithrombin levels. Thus, we identified the first PMM2-CDG patient diagnosed on his severe thrombotic history and deficiency of antithrombin. We also identified a new disorder, called CDG-like, which shares the same biochemical pattern as PMM2-CDG but only one clinical phenotype (thrombosis) and one out of the two required PMM2 mutation. Interestingly, these CDG-like disorders seems to have a relatively high prevalence in patients with thrombosis. These results suggest disorders of glycosylation as strong thrombophilic disorders and encourage the analysis of this disorder among patients with thrombosis and antithrombin deficiency but no mutations in the SERPINC1. This study opens new attractive questions that must be answered: additional key regulatory regions of SERPINC1 must exist and they should be identified; other antithrombin modulating genes must be explored and genetic modifications affecting these genes should be studied in a context of a potential role in thrombosis; the real incidence of CDG-like disorders on thrombotic diseases must be clarified; and the mechanism involved in the abnormal haemostatic system and risk of thrombosis of PMM2-CDG and CDG-like patients should be characterized. WC:600 La antitrombina es anticoagulante endógeno clave en el control de la hemostasia. Cualquier factor que afecte a esta molécula podría desequilibrar el sistema hemostático, y contribuir a incrementar el riesgo trombótico. Se han identificado más de 296 mutaciones diferentes en el gen que codifica antitrombina, SERPINC1, en pacientes con trombosis venosa y deficiencia de antitrombina. Sin embargo, apenas hay estudios que hayan buscado otros elementos capaces de afectar los niveles de este anticoagulante. Objetivo. Identificación de nuevos genes y/o modificaciones genéticas involucradas en la regulación de los niveles de antitrombina. Métodos. Estudiamos 29 pacientes con deficiencia de antitrombina moderada o grave sin mutación en la región codificante de SERPINC1. Se incluyeron una cohorte familiar (GAIT), 307 donantes de sangre sanos, tres estudios caso-control de diferentes enfermedades tromboembólicas de dos países (España y Dinamarca) con 2,980 pacientes y 3,996 controles. Finalmente estudiamos 2 pacientes con trastorno de glicosilación congénita (PMM2-CDG), un desorden muy raro y un paciente con severo alcoholismo. Para el desarrollo del proyecto se empleó metodología molecular que abarca desde genotipado de alteraciones puntuales empleando diferentes sistemas (sondas taqman, PCR-ASRA), hasta GWAS, pasando por la cuantificación de expresión y secuenciación de genes(SERPINC1, LARGE, PMM2). También se usó metodología bioquímica clásica (electroforesis en geles desnaturalizantes y nativos, purificación o separación de proteínas mediante FPLC o HPLC, estudios de inhibición), y metodología más avanzada (proteómica y glicómica). Finalmente, se empleó metodología celular (inmunofluorescencia, estudios de reporter y silenciamiento génico). Resultados. El análisis del gen SERPINC1 completo en sujetos con deficiencia de antitrombina sin mutaciones en zonas codificantes, identificó la primera mutación en la región promotora del gen asociada con deficiencia de antitrombina. Este resultado permitió no sólo identificar nuevas regiones reguladoras, sino también sugerir el análisis de esta región en estudios moleculares de pacientes con deficiencia de antitrombina. Confirmamos la baja variabilidad genética de SERPINC1, en particular en la región de codificante, probablemente debida a la gran sensibilidad conformacional y funcional de esta serpina. Además, encontramos que la variabilidad genética de SERPINC1 parece tener poca relevancia en la regulación de los niveles de este anticoagulante en población sana. Este resultado, junto con la alta heredabilidad de este fenotipo, sostiene la existencia de otros factores genéticos en la modulación de los niveles de antitrombina. Así, el estudio GWAS y estudios de validación, junto con otros resultados funcionales identificaron el primer gen modulador de antitrombina. La alteración de la expresión del gen LARGE redujo la secreción de antitrombina potencialmente por la función intracelular de moléculas heparan-like generadas por las actividades xilosiltransferasa y glucoroniltransferasa de LARGE. Nuestro estudio ha identificado además que anomalías globales de glicosilación reducen los niveles de antitrombina. Así, se identificó el primer paciente PMM2-CDG diagnosticado en base a su historia trombótica severa y su deficiencia de antitrombina. También se caracterizó un nuevo desorden, llamado CDG-like que comparte el mismo patrón bioquímico que PMM2-CDG, una de las dos mutaciones requeridas en PMM2 pero sólo trombosis como fenotipo clínico. Curiosamente, CDG-like parece tener alta prevalencia en pacientes con trombosis. En conjunto, estos resultados apoyan que los trastornos de glicosilación pudieran considerarse como factor trombofílico que debería estudiarse en pacientes con moderada deficiencia de antitrombina. Esta tesis muestra nuevos mecanismos implicados en la variabilidad de antitrombina. Además, abre nuevas líneas de trabajo y deja cuestiones aún por resolver: la existencia de nuevas regiones reguladoras en el gen SERPINC1 aún por identificar, la existencia de otros genes moduladores de antitrombina con potencial relevancia trombótica, la incidencia de trastornos de glicosilación en trombosis, y el mecanismo por el cual PMM2-CDG y CDG-like elevan el riesgo trombótico. WC:591