Estudio genético de muerte súbita en la Región de Murcia

Resumen

RESUMEN Objetivos 1) Estudiar las causas de MS no isquémica en la Región de Murcia. 2) Describir desde el punto de vista histopatológico los casos de MS con sospecha o evidencia de miocardiopatía. 3) Evaluar el funcionamiento de un protocolo de estudio patológico, genético y familiar de los casos de MS no isquémica. 4) Identificar las alteraciones genéticas asociadas a las causas de MS con sospecha de cardiopatía hereditaria. 5) Estudiar mediante el uso de herramientas bioinformáticas la causalidad de las variantes encontradas y estimar su patogenicidad, mediante la relación entre el tipo de variante y las manifestaciones clínicas (correlación genotipo-fenotipo). 6) Estudiar la segregación de la enfermedad con el genotipo y su penetrancia a partir del estudio de familiares de primer grado de los afectados. Metodología 1. Autopsia Se realizó un estudio necrópsico completo con disección reglada del corazón por especialistas del IMLRM. Se procedió a la recogida, conservación y almacenamiento de muestras sanguíneas (2 tubos EDTA, 4 ml), para la realización del estudio molecular, dichas muestras de sangre fueron tratadas, siguiendo procedimiento habitual para purificación y amplificación del DNA. 2. Estudio familiar Se trazaron árboles familiares de forma detallada. Se realizó un estudio clínico completo, en función de cada caso. Se interrogó acerca de la edad y las causas de los fallecimientos y se recogió la historia médica, en los casos en que esta información estaba disponible. 3. Análisis estadístico Se creó una base de datos específica para el estudio. Se empleó el programa estadístico SPPS (versión 15.0) para el análisis de resultados. 4. Estudio molecular Miocardiopatías Genes estudiados MCH MYBPC3, MYH7 HIVI MYBPC3, MYH7 MAVD PKP2, DSP, DSG2 MCD LMNA Dilatada/Espongiforme MYBPC3, MYH7, LMNA, Cypher/ZASP Canalopatías Genes estudiados SQTL SCN5A, KCNQ1, KCNH2 SB SCN5A SQTC KCNQ1, KCNH2 Tabla 1. Resumen de los genes estudiados por secuenciación directa. a) Extracción del ADN genómico b) Amplificación y purificación del ADN genómico c) Secuenciación automática directa d) Next generation secuencing e) Análisis bioinformático de las variantes encontradas f) Análisis bioinformático de las nuevas variantes identificadas: Estudios In silico Conclusiones 1) La incidencia media de casos de MS relacionados con cardiopatías hereditarias, estimada en la Región de Murcia, fue de 14 personas/año con una media de edad al diagnóstico de 36,0±19,6 años. 2) Existe un claro predominio del sexo varón en todos los casos de MS de nuestra población, destacando la asociación significativa en el grupo de las MCP. 3) El estudio histológico o la evaluación cardiológica exhaustiva, permitieron obtener un rendimiento diagnóstico en el 60,9% de los casos, siendo la MCH la causa de MS más común en nuestro medio. 4) Mediante el estudio molecular dirigido de en los 50 casos de MS, con sospecha o evidencia de cardiopatía hereditaria, se ha conseguido un rendimiento global del diagnóstico genético positivo del 10,0%. 5) Tras el análisis con herramientas in silico, la consulta en la literatura científica y el estudio de la relación genotipo-fenotipo, se ha considerado que el 30,0% de los casos portaba al menos una variante de significado clínico incierto, se han identificado entre ellas, variantes missense de mayor probabilidad patógena. 6) Como estrategia diagnóstica, el análisis molecular contribuyó a aumentar el rendimiento diagnóstico positivo; de los familiares estudiados clínica y genéticamente, el 27,5% era portador de al menos una de las mutaciones identificadas como causantes o probablemente causante de la enfermedad, el 16,0% estaba afectado clínicamente y el 10,3% no lo estaba. 7) La creación de un grupo multidisciplinar que integra patólogos, cardiólogos y biólogos moleculares, ha permitido profundizar en las causas de MS en la Región de Murcia ABSTRACT Objectives 1) To study the causes of nonischemic sudden death in Murcia. 2) To describe from a histopathological point of view, cases of sudden death with evidence or suspected of cardiomyopathy. 3) To evaluate the performance of an organized pathological, genetic and family study of cases of nonischemic sudden death 4) To identify genetic alterations associated with the causes of sudden death with suspected hereditary disease. 5) To study the causality of the variants found, by bioinformatics tools and estimate its pathogenicity by the relationship between type of variation and clinical manifestations (genotype-phenotype correlation). 6) To study the segregation of the disease with genotype and its penetrance from of first-degree relatives of those affected. Methods 1. Autopsy A full necropsy with formal dissection of the heart was performed by specialists of the Institute of Legal Medicine of the Region of Murcia (IMLRM). To realize molecular studies, we proceeded to the collection, preservation and storage of blood samples (2 EDTA tubes, 4 ml), these blood samples were treated, following routine purification and DNA amplification procedure. 2. Family Study Family pedigrees were outlined in detail from the questioning of patients and families. A complete clinical study was made, depending on each case. Families were questioned about the age and cause of death and medical history was collected, in cases where this information was available. 3. Statistical Analysis Specific data base was created for the study. SPPS statistical software (version 15.0) was used for the analysis of results. 4. Molecular study Cardiomyopathy Studied Genes MCH MYBPC3, MYH7 HIVI MYBPC3, MYH7 MAVD PKP2, DSP, DSG2 MCD LMNA Dilatada/Espongiforme MYBPC3, MYH7, LMNA, Cypher/ZASP Channelopathies Studied Genes SQTL SCN5A, KCNQ1, KCNH2 SB SCN5A SQTC KCNQ1, KCNH2 Table 1. Summary of the studied genes by direct sequencing for each cardiomyopathies and / or channelopathies. a) Extraction of genomic DNA. b) Amplification and purification of genomic DNA. c) Automatic direct sequencing. d) Next generation secuencing. e) Bioinformatic analysis of the variants found. f) Bioinformatic analysis of the new genetic variants identified: in silico studies. Conclusions 1) It was estimated that the average incidence of sudden death related hereditary disease, estimated in Murcia, was 14 people/ year with a mean age at diagnosis of 36.0 ± 19.6 years. 2) A clearly predominance of male sex in all cases of sudden death in our population was shown, highlighting the significant association in the group of Cardiomyopathies. 3) Histological examination or comprehensive cardiac evaluation (in case of a resurrected cardiac arrest), showed a yield of 60.9%, being MCH the most common cause of sudden death in our clinical area. 4) Using molecular studies on 50 cases of sudden death, with evidence or suspected of hereditary disease, it has achieved an overall yield of positive genetic diagnosis of 10.0%. 5) After analysis with in silico tools, scientific literature consultation and the study of genotype-phenotype relationship, it is considered that the 30.0% of cases carrying at least one variant of uncertain clinical significance. Have been identified, missense variants of pathogenic greater probability. 6) As a diagnostic strategy, molecular analysis helped to increase the positive diagnostic yield; relatives clinically and genetically studied, 27.5% were carrying at least one of the mutations identified as causing or likely to cause the disease, 16.0% were clinically affected and 10.3% was not. 7) The multidisciplinary group created, which it is integrated by pathologists, cardiologists and molecular biologists, has allowed deepened in sudden death causes in Murcia.