Efectos "in vitro" de tres extractos del capullo del gusano de la seda frente a la radiación ultravioleta B

Resumen

I. RESUMEN Durante las últimas décadas la exposición solar ha sufrido un aumento considerable, sobre todo la recreativa o intermitente, por lo que el fotoenvejecimiento afecta también a jóvenes que se exponen al sol sin protección o a fuentes ultravioleta artificiales para el bronceado rápido (Camacho, 2001), de ahí, la inversión millonaria que se realiza en Occidente en investigación de sustancias que eviten o retrasen los efectos del fotoenvejecimiento, tanto por estética como por el coste económico del tratamiento de las lesiones. En los últimos años, los aceites esenciales han suscitado gran interés debido a su capacidad antioxidante, que podría interferir en los mecanismos del fotoenvejecimiento, evitando la formación de radicales libres y potenciando el subsistema inmunológico cutáneo (Siegel, 2012). En nuestro trabajo hemos ensayado tres extractos procedentes del capullo del gusano de la seda: fibroína, sericina e hidrolizado para conocer sus efectos "in vitro": a) Citotóxicos (viabilidad y proliferación celular) sobre las líneas celulares: Vero, TRAMP-C1 y HaCaT. b) Genotóxico y genoprotector sobre sangre total humana. c) Sobre la migración celular y protección frente a la radiación ultravioleta B en la línea celular HaCaT. En los ensayos de CITOTOXICIDAD sobre las células Vero, ni la fibroína ni el hidrolizado de seda fueron citotóxicos, mientras que la sericina provocó una disminución de la viabilidad celular dosis-respuesta significativa, moderadamente citotóxica. Las células TRAMP-C1 mostraron valores de viabilidad celular a las 24 y 48 horas muy próximos a los controles (casi del 100%) por lo qué ninguno de los extractos: fibroína, sericina e hidrolizado de seda presentaron acción anticancerosa sobre la línea celular TRAMP-C1 a las concentraciones estudiadas.El objetivo del ensayo de citotoxicidad para las células HaCaT fue ajustar las dosis de los extractos para poder utilizar la máxima concentración que admitiera el cultivo sin que afectara a su viabilidad y poder llegar hasta ese punto con el ensayo de fotoprotección y migración. La fibroína no fue citotóxica hasta 0,1%, a partir del cual mostró cierto efecto citotóxico estadísticamente significativo dependiente de la dosis. La sericina resultó más citotóxica como también constatamos sobre la línea Vero. Este efecto comenzó a hacerse evidente con las concentraciones más bajas (0,05 y 0,1), alcanzando la IC 50 de forma temprana en 0,22% a las 24 horas y 0,16% a las 48 horas. El efecto negativo dosis-respuesta sobre el cultivo fue estadísticamente significativo a partir del 0,05%. El hidrolizado de seda mostró mejor comportamiento respecto a la viabilidad de estas células, con valores próximos e incluso superiores al 100% (control) en todas las concentraciones estudiadas a 24 y 48 horas. Por lo que el hidrolizado de seda no afecta a la viabilidad celular de esta línea. En el ensayo de GENOTOXICIDAD, no existían diferencias estadísticamente significativas en el número de micronúcleos por 500 CB en las muestras tratadas con los tres extractos respecto a las controles. En el ensayo de GENOPROTECCIÓN, observamos disminución de MN/500 CB cuando se administraban los tratamientos (fibroína, sericina e hidrolizado de seda) previamente a la irradiación aunque ninguno mostró disminución estadísticamente significativa respecto al control irradiado. Por lo que parece existir tendencia a la protección frente al daño producido por la radiación X. En cuanto a la MIGRACIÓN CELULAR, el hidrolizado de seda no mostró diferencias estadísticamente significativas a las concentraciones estudiadas (0'01 y 0'1 %) en relación a la migración de las células HaCaT. El estudio de FOTOPROTECCIÓN presentó resultados significativos (p < 0'001) para el hidrolizado y la fibroína, resaltando el importante incremento de la viabilidad celular a las 24 y 48 horas causado por el hidrolizado de seda a las concentraciones 0,001; 0,01; 0,05 y 0,1, y la mínima intensidad de radiación ultravioleta (0,08 J/cm2), lo que consideramos de gran relevancia clínica por la facilidad de incorporación de una dosis tan baja de hidrolizado de seda a un producto fotoprotector. I. SUMMARY In the last decades the sun exposition, specially recreative or intermitent, has led to a tremendous increase in skin cancer. Photo-aging also affects young people who have exposed to the sun or artificial UV sources without protection (Camacho, 2001). For that reason, the Occidental Countries have made a millonair inversion in research studies on substancies to avoid or delay the photo-aging effects. During the last years, the esential oils have aroused great interest because of their antioxidant capacity, which could affect on photodamage mecanism, avoiding the free radycals formation and enhancing the cutaneous inmune subsystem (Siegel, 2012). II. OBJETIVES General Objective The main objective of this thesis was to compare three extracts from silkworm: fibroin, sericin and silk hidrolyzate in order to know their "in vitro" effects: a) Cytotoxic (viability and celular proliferation) on celular lines: Vero, TRAMP-C1 and HaCaT. b) Genotoxic and genoprotective on total human blood. c) Celular migration and protecction against ultravioleta B radiaton on celular line HaCaT. Specific Objectives 1º. To evaluate the cocoon of silkworm efectts: fibroin, sericin and silk hidrolyzate upon proliferation and citotoxicity of celular lines: TRAMP-C1 y HaCaT. 2º. To study the genotoxic and genoprotective silkworm extracts over total human blood. 3º. To identify the activity of silkworm extracts upon celular migration in HaCaT line. 4º. To analyze, in HaCaT line, the silkworm extracts protective effects against ultraviolet B radiation. III. RESULTS Neither fibroin or silk hydrolyzate were citotoxic upon Vero celular line trial, while sericine caused a significant disminution celular dose-response, moderately citotoxic. Fibroin was not citotoxic until 0,1%, after that concentration it showed a light dose-dependent citotoxic effect statistically significant. Sericine was more citotoxic over Vero celular line. This effect was more evident with lower concentrations (0.05 y 0.1), with sooner IC 50 on 0.22% at 24h and 0.16% at 48h. The negative dose-response effect over the cultive was estatistically significant from 0,05%. The silk hydrolyzate showed a better response respect these cells viability, with values closer or higher to 100% (control) in all the studied concentrations within 24 and 48 hours. So the silk hydrolyzate does not affect this celular line's viability. The TRAMP-C1 cells showed celular viability values within 24 and 48 hours closer to control (near 100%) so no one of the extracts: fibroin, sericin and silk hydrolyzate showed anticancer action over TRAMP-C1 celular line in studied concentrations. In the GENOTOXICITY trial, did not exist statistically significant differences in the number of MN/500 CB in the samples treated with the three agents respect to the control. In the GENOPROTECTION trial, a disminution of MN/500 CB was observed when treatments (fibroin, sericin and silk hidrolyzate) were administrated previously to the irradiation although no one showed a statistically significant disminution respect the irradiated control. So there seems to be a protection against X radiation. As regard the CELULAR MIGRATION, the sylk hydrolyzate did not show statistically significant differences in studied concentrations (0.01 y 0.1 %) related with migration of celular line HaCaT. The PHOTOPROTECTION study showed significant results (p < 0.001) for the silk hydrolyzate and fibroin, with an important cellular viability increase within 24 y 48 hours caused by the hydrolyzate 0.001, 0.01, 0.05 and 0.1 concentrations and the ultraviolet minimun intensity radiation (0.08 J/cm2). Silk hydrolyzate should be considered as a photoprotective agent with a high clinic relevance, due to its activity in very low doses.