Avances en el conocimiento de la cromogranina A y otros biomarcadores salivares de estrés en cerdos

Resumen

Esta tesis doctoral, por compendio de artículos, ha sido diseñada con el fin de producir avances en la medición de biomarcadores de estrés y para desarrollar y validar un panel de biomarcadores salivares para evaluar los diferentes sistemas fisiológicos (simpático-adrenomedular (SAM), hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA), hipotálamo-pituitario-gonadal (HPG) y sistema inmune) que participan en el mecanismo de estrés. Para ello, los objetivos de esta tesis son los siguientes: desarrollar y validar un ensayo inmunofluorométrico a tiempo resuelto (TR-IFMA) para las mediciones de cromogranina A (CgA) salivar porcina, utilizando un anticuerpo específico de la especie, y evaluar su comportamiento como posible biomarcador del sistema SAM en un modelo de estrés agudo. Además, estudiar si las concentraciones de CgA salivar exhiben un patrón circadiano durante el día, y evaluar su estabilidad bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Por otra parte, validar inmunoensayos disponibles comercialmente para la cuantificación de cortisol (biomarcador del sistema HPA), testosterona (biomarcador del sistema HPG) e IgA (biomarcador del sistema inmune) en la saliva de los cerdos. Evaluar la respuesta de un panel de varios biomarcadores salivares tanto del sistema inmune como del sistema neuroendocrino a la administración repetida de Escherichia coli lipopolisacárido (LPS) y, por último, investigar la respuesta de todo este grupo de biomarcadores salivares después de aplicar un modelo de estrés psicosocial en cerdos basado en el aislamiento y el reagrupamiento. En cuanto a la metodología empleada, los anticuerpos policlonales específicos producidos para el desarrollo del TR-IFMA fueron obtenidos mediante la inmunización con un péptido recombinante de proteína CgA porcina. La precisión, exactitud y sensibilidad analítica del TR-IFMA desarrollado y de los inmunoensayos comerciales empleados fueron evaluadas mediante los coeficientes de variación intra- e interensayo, la linealidad bajo dilución y el porcentaje de recuperación, el límite de detección y los límites de cuantificación. Para estudiar la respuesta de los biomarcadores salivares frente al estrés se emplearon modelos en los que los animales fueron inmovilizados con un acial o transportados a matadero. Tomando muestras de saliva antes y después de aplicar dichos estímulos estresantes. Por otro lado, en el caso de la administración de LPS, los cerdos que fueron utilizados recibieron tres dosis de LPS en intervalos de 48 h. Las muestras de saliva fueron tomadas antes de la administración de LPS y 3 h después de cada una de las administraciones. Por otra parte, en el modelo de aislamiento y reagrupamiento todos los animales se adaptaron a la vida en grupo durante 5 días, después de lo cual, un grupo de cerdos fueron sometidos al procedimiento de aislamiento, donde los animales permanecieron sin contacto físico con otros cerdos durante 5 días. Después, los cerdos del ensayo se reagruparon de nuevo durante 3 días, regresando a las condiciones iniciales. Los cerdos controles permanecieron en las mismas condiciones durante todo el estudio. Las muestras de saliva se tomaron diariamente, a la misma hora, y un muestreo adicional fue realizado a los 30 min tras los procedimientos de aislamiento y reagrupado. En general, nosotros podemos concluir de este trabajo que: el TR-IFMA desarrollado permite la cuantificación de CgA en muestras de saliva porcina de una forma precisa, exacta y sensible y su concentración aumenta significativamente después de una situación de estrés agudo. Además, no ha sido detectado un patrón circadiano para la CgA salivar y este biomarcador fue bastante estable, siendo posible su almacenamiento hasta un año a -20ºC o -80ºC. Por otra parte, los inmunoensayos comerciales validados para las concentraciones de cortisol, testosterona e IgA pueden ser utilizados para su uso en muestras de saliva de cerdos con una buena precisión, sensibilidad y exactitud. En cuanto a la administración de LPS, una sola administración en cerdos produce incrementos de IgA salivar y cortisol. Sin embargo, administraciones repetidas solo producen incrementos en IgA mientras que el cortisol retorna a valores basales. No se observaron variaciones en las concentraciones de CgA ni con una sola administración ni con administraciones repetidas. Finalmente, el uso de un panel de biomarcadores salivares podría ser esencial en la investigación de estrés, ya que estos reaccionan de manera diferente a diversos tipos de factores estresantes. En el caso del aislamiento, CgA e IgA parecen ser marcadores más sensibles que el cortisol y la testosterona, mientras que después del proceso de reagrupado, el cortisol, la testosterona y la CgA parecen ser marcadores más sensibles que la IgA.