Caracterización funcional y molecular de trombopatías congénitas= Functional and molecular characterization of inherited platelet disorders

Laburpena

Introducción Los trastornos plaquetarios congénitos son un grupo heterogéneo de enfermedades raras que se caracterizan por alterar la producción/función plaquetaria, dando lugar a diátesis hemorrágica. A pesar de que estas enfermedades son muy conocidas, la identificación temprana y la caracterización de los pacientes sigue siendo difícil debido a la heterogeneidad clínica y de laboratorio; la falta de especificidad y la complejidad de los ensayos de la función plaquetaria; el gran número de genes causales; y la ausencia de correlación genotipo-fenotipo. Los proyectos multicéntricos sobre estos trastornos, guías consenso para el diagnóstico y redes de centros de referencia, podrían ayudar a abordar este problema. Objetivos 1. Facilitar el acceso al diagnóstico funcional y molecular de trastornos plaquetarios congénitos, para la comunidad médica de la Península Ibérica, promoviendo y apoyando la formación de un proyecto de colaboración para el reclutamiento y estudio de pacientes con un diagnóstico previo o con sospecha clínica de estos trastornos. 2. Realizar una evaluación cuantitativa de diátesis hemorrágica en los pacientes por medio de una escala común de sangrado. 3. Completar un análisis detallado y estandarizado de la función plaquetaria en los pacientes reclutados, con el objetivo de confirmar o descartar el diagnóstico funcional. 4. Lograr un diagnóstico molecular en los individuos con un diagnóstico funcional confirmado. 5. Establecer las posibles relaciones entre fenotipo clínico y/o de laboratorio y genotipo. Métodos En cinco años, 70 pacientes (no emparentados) con sospecha de trastorno plaquetario congénito, se remitidos desde hospitales de España y Portugal. Las características clínicas y manifestaciones hematológicas fueron evaluadas mediante una escala de sangrado. Se caracterizó el fenotipo plaquetario mediante un hemograma y un frotis; test PFA-100; ensayos de agregación plaquetaria; evaluación de los receptores de superficie plaquetarios y el estado de activación y secreción de gránulos por citometría de flujo; en algunos casos se realizó el ensayo de retracción del coágulo, la absorción/liberación de serotonina-14C, y microscopía electrónica. Se estudió en paralelo un control extraído a la vez que el paciente y un voluntario sano extraído en el momento del estudio. El análisis genético consistió, principalmente, en la secuenciación de regiones codificantes de los genes de interés. Resultados y Conclusiones 1. Hemos promovido un proyecto de colaboración para promocionar el diagnóstico funcional y molecular de pacientes con sospecha clínica de trastornos plaquetarios congénitos. Esto ha permitido el diagnóstico de un elevado número de pacientes. 2. Esta tesis comprende el estudio de 70 pacientes, siendo la cohorte de pacientes con sospecha clínica de trastornos plaquetarios congénitos más extensa de la Península Ibérica. 3. Nuestro estudio demuestra que mientras que una estrategia para el envío de muestras de sangre a una instalación distante puede no ser ideal y supone limitaciones técnicas, es válido para la identificación funcional de los pacientes con fenotipos severos. 4. En el 67% de los casos remitidos, se confirmó el diagnóstico, mientras que en el 33% restante no se ratificó la sospecha clínica. 5. El 40% de los pacientes obtuvo un diagnóstico a nivel molecular, el 28,8% con TG, y el 17,7% con SBS. La caracterización molecular de estos pacientes reveló 22 mutaciones, 11 fueron descritas aquí por primera vez. 6. Se identificaron dos nuevas variantes de SCH. Describimos por primera vez un caso de la forma severa de la enfermedad debido a una mutación missense en homocigosis. 7. Se describe el segundo caso de la caracterización molecular de un paciente con SHP en España, mediante secuenciación directa de gen HPS1. También se describió una mutación en el gen HPS7 en otro paciente, empleando el mapeo de marcadores microsatélites para detectar el gen candidato para secuenciación. 8. El análisis de otros casos con sospecha de trastornos plaquetarios congénitos, confirmó el diagnóstico molecular de CAMT, THC2 y MYH9-RD en 5 pacientes 9. El estudio del paciente con trombocitopenia crónica y tendencia hemorrágica leve, puso de manifiesto la primera evidencia de un autoanticuerpo IgM que causa la activación y agregación de plaquetas autólogas y alogénicas dependiente de temperatura, vía GPVI. En resumen, esta Tesis destaca la necesidad de mejorar el diagnóstico de los trastornos plaquetarios congénitos a nivel funcional y molecular. Se debe considerar el establecimiento de criterios estandarizados para evitar la heterogeneidad entre las distintas instalaciones, y la creación de centros de referencia para colaborar y favorecer el diagnóstico correcto de estas enfermedades. Introduction Inherited platelet disorders (IPDs) comprise a heterogeneous group of rare diseases characterized by abnormalities of platelet production or function giving rise to lifelong bleeding diathesis. Despite a century of research on IPDs, early identification and characterization of affected patients remain a challenge due to: heterogeneity of clinical and laboratory presentation; lack of specificity and complexity of platelet function assays; large number of causative genes; and absence of genotype-phenotype correlations. Multicenter projects on IPDs, consensus guides for diagnosis, and reference centers networks, could help to overcome this challenge. Objectives 1. To facilitate access to the specialized functional and molecular diagnosis of IPDs, for the medical community of the Iberian Peninsula, by promoting and initiating a collaborative project for the recruitment and study of patients with a previous diagnosis or clinical suspicion of either inherited thrombocytopenias or congenital disorders of platelet function. 2. To perform a quantitative re-evaluation of bleeding diathesis in the recruited patients by means of a common bleeding scale. 3. To complete a detailed and standardized analysis of platelet function in the samples from recruited patients, aiming to confirm or discard a functional diagnosis. 4. To achieve a molecular diagnosis in the individuals with a confirmed laboratory diagnosis. 5. To establish potential relationships between clinical and/or laboratory phenotype and genotype, in different types of IPDs. Methods In five years, seventy unrelated patients with suspected IPD were referred from hospitals of Spain and Portugal. Clinical features were assessed by their hematological and bleeding manifestations graded by a unique simple scale. We received blood samples and performed a platelet phenotype characterization including: full blood count and film examination; PFA-100 tests; light transmission aggregation (LTA); flow cytometry assessment of surface receptors, activation status and granule secretion; and in some cases clot retraction assay, 14C-serotonin uptake/release, and electron microscopy. A patient's parallel control and a healthy volunteer freshly extracted were studied in parallel. Genetic analysis was mainly performed by sequencing of coding regions of the genes of interest. Results and Conclusions 1. The collaborative project promoted through this Thesis has permitted the accurate diagnosis of a high number of patients that will benefit from more specific medical management. 2. This Thesis comprises the largest cohort of patients with IPDs ever investigated in the Iberian Peninsula. 3. Our study demonstrates that despite a strategy for sending blood samples to a distant facility may not be ideal and not free of technical limitations, it is valid for functional identification of patients with severe phenotypes. 4. The clinical diagnosis of an IPD was confirmed in 67% of the 70 cases referred, while in the remaining 33% was not. Thus, our study demonstrates that correct diagnosis of IPDs may not be straightforward even for severe disorders and supports the benefit of specialized platelet laboratories for the diagnostic confirmation in these patients. 5. A high percentage of patients (40%) achieved a diagnosis at a molecular level, 28.8% with GT, and 17.7% with BSS. The molecular characterization of patients with GT revealed sixteen mutations along both genes encoding for the IIb 3 receptor, 8 not reported previously. In the case of BSS, six mutations were identified, 3of them firstly described in this study. 6. We identified two new variants of CHS in this study. Noteworthy, we describe for the first time a case of a severe infant-onset CHS due to a homozygous missense mutation. 7. We characterized at the molecular level the second case of HPS-1 in Spain. A novel mutation in the HPS7 gene was identified in another HPS patient following autozygosity mapping using microsatellite markers to identify the candidate gene for Sanger sequencing. 8. Other cases with IPDs attained a molecular diagnosis of CAMT, THC2, and MYH9-RD. 9. The study of a patient with lifelong chronic thrombocytopenia and mild bleeding tendency, provided the first evidence of an IgM autoantibody causing temperature-dependent activation and aggregation of autologous and allogeneic platelets, through interaction with the platelet collagen receptor GPVI. In summary, this Thesis highlights the need to improve the diagnosis of IPDs at the level of the functional and by molecular analysis. Standardized criteria for diagnosis of IPDs would overcome the present heterogeneity between facilities, and the creation of reference centers should be considered to help healthcare providers in the diagnosis of these disorders.