Estrategias de ingeniería metabólica y biología de sistemas aplicadas a la producción de L(-)carnitina por Escherichia coli= Metabolic engineering and systems biology strategies for L(-)carnitine production in Escherichia coli

Resumen

RESUMEN Esta Tesis Doctoral recoge el trabajo de investigación que se ha realizado en dos líneas desarrolladas de forma paralela sobre Escherichia coli. Por un lado, la optimización de un proceso de biotransformación para mejorar la síntesis de L( )-carnitina mediante técnicas de ingeniería metabólica. Y por otro, la determinación de los principales efectos que provoca la exposición prolongada a altas concentraciones de sal y su respuesta de adaptación, principalmente cuando las fuentes de carbono pueden contener altas concentraciones de sal y tanto el sustrato como el producto son osmoprotectores. Para ello, se han aplicado técnicas utilizadas por la biología de sistemas y la ingeniería metabólica. La importancia de L( )-carnitina viene determinada por el papel que desempeña en el metabolismo energético, de hecho su deficiencia está asociada a diversas patologías. Varios trabajos centrados en la aplicación terapéutica de L( )-carnitina han demostrado que su administración puede ayudar a suplir dicha carencia. A partir de este punto, comienza una creciente actividad investigadora centrada en la producción de L( )-carnitina. Este trabajo presenta un método alternativo basado en la utilización de E. coli para llevar a cabo la biotransformación de compuestos de bajo valor añadido como puede ser D(+)-carnitina y/o crotonobetaína en L( )-carnitina. Por medio de técnicas de biología molecular se ha modificado genéticamente una cepa de E. coli, consiguiendo la sobreexpresión de caiC y mejorando el rendimiento de la cepa silvestre. Además, para optimizar la producción de L( )-carnitina se han estudiado aspectos relacionados con el metabolismo de carnitina como la disponibilidad de coenzima A o la inhibición de una ruta metabólica que favorezca la transformación del sustrato en L( )-carnitina. Posteriormente, se obtuvo una cepa modificada más estable y con una alta capacidad para la producción de L( )-carnitina, para ello se han implementado diversas estrategias de ingeniería metabólica. Las mutaciones implicadas en la mejora de esta cepa fueron: a) la deleción del gen aceK para incrementar el flujo hacia el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, b) la deleción del gen caiA para impedir la síntesis de ?-butyrobetaína (productos del metabolismo de carnitina), y c) la sustitución del promotor natural altamente regulado del operón cai por un promotor artificial constitutivo. Con dichas mutaciones implementadas en una misma cepa, no sólo se consiguió aproximadamente un 100 % de conversión de crotonobetaína en L( )-carnitina en las condiciones de ensayo, sino que también la limitación impuesta por la presencia de oxígeno fue superada por este mutante, lo que indica la importancia de la ingeniería metabólica en la mejora de procesos biotecnológicos. L(-)-carnitina o compuestos similares son utilizados como osmoprotectores, acumulándolos en el interior celular, para evitar la deshidratación cuando la osmolaridad del medio se incrementa. Ante estas situaciones, los microorganismos pueden adaptarse y dar una respuesta pasajera, o realizar un proceso de adaptación para mantener su supervivencia mientras el estrés está presente. En este trabajo, se observó la evolución y la respuesta generada de una cepa de E. coli cultivada en un reactor continuo y sometida a tres concentraciones crecientes de sal (moderada, alta y muy alta). La medida de las actividades enzimáticas de las principales rutas metabólicas, así como la determinación de los metabolitos fermentativos producidos, resaltaron el importante papel ejercido por el metabolismo central en la adaptación y en la supervivencia celular tras una larga exposición a estrés salino, así como la necesidad de disponer de precursores biosintéticos y de energía en forma de ATP. Además, se profundizó en el estudio del comportamiento celular realizando una aproximación desde la biología de sistemas, integrando los niveles metabolómico, flujómico y transcriptómico. Se debe destacar que se observaron dos conjuntos de respuestas consecuencia de la concentración de sal presente en el medio. Uno dirigido a mantener unos niveles energéticos umbrales en la célula, basado tanto en el incremento de los flujos metabólicos hacia rutas que permitían la generación de energía, como en la reducción de procesos no esenciales para la supervivencia. Y otro, una respuesta característica en las células expuestas a alta o a muy alta concentración de sal, que estuvo caracterizada no sólo por cambios en los patrones de fermentación metabólica sino también por una alteración significativa del estado redox celular. Así, con el uso de técnicas apropiadas se han podido detectar un gran número de cambios en la fisiología y el metabolismo de E. coli. Además, la aproximación de la biología de sistemas ofrece una forma de obtener e integrar gran cantidad de información, que de otra forma se perdería por la cantidad de información que se obtiene. Finalmente, la ingeniería metabólica y la biología de sistemas han aportado una excelente manera de mejorar y conocer las características de los microorganismos involucrados en los procesos biotecnológicos relacionados con la producción de L( )-carnitina. SUMMARY Two parallel research aims addressed on Escherichia coli are shown in this PhD thesis. On one hand, the optimization of a biotransformation process in order to improve L( )-carnitine synthesis by using metabolic engineering techniques is explained within the first chapters. On the other hand, in the following chapters, the main effects provoked by long-term high salt concentrations and the adaptative response to osmotic stress were determined using different techniques related to systems biology. L( )-carnitine is an important trimethylammonium compound because of its role in the energetic metabolism, in humans, several pathologies are related with deficiencies of carnitine level. Several works focused on the therapeutic application of L( )-carnitine, showed that administration of this compound could be a solution as opposed to its absence. Once different carnitine production ways were revised, this work shows an alternative method using Escherichia coli to carry out the biotransformation from D(+)-carnitine and/or crotonobetaine into L( )-carnitine. By using molecular biology techniques a strain of E. coli was engineered, obtaining caiC overexpression and enhancing the production yield respect to the wild type strain. Moreover, several aspects related with carnitine metabolism, such as coenzyme A availability and the inhibition of specific metabolic pathways were studied to optimize the carnitine production. Afterwards, various metabolic engineering strategies were implemented, obtaining a stable engineered strain with high capacity to produce L( )-carnitine. The modifications carried out were: a) deletion of the aceK gene (encoding a bifunctional protein phosphatase/kinase which performs post-translational control of isocitrate dehydrogenase) in order to increase the metabolic flux towards TCA cycle, b) deletion of the caiA gene (encoding the crotonobetainyl-CoA reductase) to avoid synthesis of ?-butyrobetaine (byproduct of the carnitine metabolism), and c) replacement of the highly regulated natural promoter of the cai operon by a constitutive promoter. These mutations implemented in the same strain led to obtaining almost 100% conversion from crotonobetaine to L( )-carnitine in the assay conditions. Moreover, the main restrictions impossed to the aerobic expression of the carnitine metabolism were eliminated producing L( ) carnitine in the presence of oxygen. Therefore, this work emphasizes the important role of metabolic engineering to improve any biotechnological process. On the other hand, L( )-carnitine and similar compounds are used as osmoprotectants, which are accumulated in high concentrations, either through the uptake from the medium or through de novo synthesis inside the cells, to avoid dehydratation when the osmolarity of the culture medium increases. Under these conditions, microorganisms have different response to an environmental stress, short-term or shock and long-term adaptation. In this work, evolution and response to long-term adaptation were analyzed in a E. coli strain growing in continuous reactors supplemented with a gradually increasing concentration of NaCl (moderate, high and very high). Enzyme activities from the main metabolic pathways and fermentative metabolites were analyzed, highlighting important role of central metabolism on adaptation and cellular survival after salt stress exposition. Furthermore, the need of biosynthetic precursors and energy as ATP were shown. In addition, a systems biology approach was conducted to study cellular behavior. In order to estimate the critical modifications undergone to overcome stress and to develop tolerance to salt, the metabolism was examined at several levels using different techniques (metabolomics, fluxomics and transcriptomics). Under salt stress conditions two set of responses were shown. One of them was focused to maintain the energetic threshold in cells, thus, either an increment of the metabolic pathways which could produce energy or a decrease of no-essential processes to survive were shown. On the other hand, cells under high or very high salt concentrations showed another similar response characterized by both changing on pattern of fermentative pathways and redox state. Therefore, using suitable techniques many changes in the physiology and metabolism of the E. coli strain in use were detected. Moreover, the systems biology approach offered a way to obtain and integrate a large amount of information, preventing some of the information being overlooked by the massive amount of data. Both the metabolic engineering and systems biology approaches have provided excellent ways to improve and know features of microorganisms involved in biotechnological processes related with the L( )-carnitine production.