Regulación de las respuestas a la luz en el hongo mucor circinelloides.

Resumen

Título: Regulación de las respuestas a la luz en el hongo Mucor circinelloides Introducción La luz regula gran cantidad de procesos fisiológicos y del desarrollo en muchos organismos. La mayoría de respuestas a la luz caracterizadas en hongos dependen de fotorreceptores de luz azul similares a la proteína Wc-1 de Neurospora crassa. La respuesta a la luz mejor conocida en el hongo Mucor circinelloides es la síntesis de ?-caroteno. En este organismo, CrgA, una proteína que muestra características de ligasas de ubiquitina, reprime la carotenogénesis en la oscuridad, afectando también a otros procesos celulares como la esporulación y el crecimiento vegetativo. Objetivos El objetivo principal de la tesis era investigar las vías de transducción de la señal luminosa en hongos, concretamente en las respuestas fototrópica y fotocarotenogénica, utilizando M. circinelloides como modelo. Este objetivo general se estructuró en los siguientes objetivos específicos: 1. Identificación y aislamiento de los genes wc-1 de M. circinelloides. 2. Caracterización de las respuestas fototrópica y fotocarotenogénica. 3. Generación de mutantes nulos para cada gen wc-1 de M. circinelloides y análisis de sus fenotipos. 4. Generación de mutantes dobles para el gen crgA y cada uno de los genes wc-1 y análisis de sus fenotipos. Metodología M. circinelloides presenta el mayor repertorio de herramientas moleculares dentro de los cigomicetos y una respuesta fotocarotenogénica medianamente caracterizada, con mutantes disponibles en genes estructurales y reguladores de la síntesis de carotenos. Los genes mcwc-1 se identificaron y clonaron utilizando una genoteca de M. circinelloides en el fago ? y mediante hibridaciones tipo Southern. Para la caracterización de los genes mcwc-1a, mcwc-1b y mcwc-1c y el estudio de su relación con el gen crgA se generaron mutantes simples y dobles (crgA?) nulos para cada uno de los genes mcwc-1. Se analizó el contenido en ?-caroteno de sus micelios y el fototropismo de los esporangióforos. También se estudiaron los cambios en los niveles de mRNAs en respuesta a la luz de los genes carotenogénicos y de los genes mcwc-1 utilizando hibridaciones tipo Northern. Además, en el caso de la proteína Mcwc-1b, se analizó su abundancia, sus modificaciones post-traduccionales y su posible interacción con CrgA por medio de hibridaciones tipo Western y co-inmunoprecipitación. Resultados y Conclusiones En primer lugar, utilizando diferentes longitudes de onda del espectro visible, se demostró que los esporangióforos de M. circinelloides poseen fototropismo positivo inducido por luz azul y verde, mientras que la carotenogénesis se induce sólo por luz azul. Además, se identificaron tres genes white-collar-1 en M. circinelloides (mcwc-1a, mcwc-1b y mcwc-1c) que codifican proteínas similares a Wc-1 de Neurospora crassa. Las tres contienen un dominio LOV (luz, oxígeno y voltaje) parecido al presente en receptores de luz azul de plantas y hongos. Los resultados obtenidos en el análisis de los mutantes simples mcwc-1? implicaron al gen mcwc-1a en el control del fototropismo y al gen mcwc-1c en la fotocarotenogénesis. Los resultados indican que mcwc-1a y mcwc-1c controlan diferentes rutas de transducción de la luz, aunque es posible que existan interacciones entre ambas rutas, ya que mcwc-1a está implicado en el regulación por luz de la expresión de mcwc-1c. Análisis de los dobles mutantes crgA? mcwc-1? demostraron que el efecto de crgA en la carotenogénesis depende de mcwc-1b, que actúa como un activador de la carotenogénesis. Por último, se demostró que CrgA está implicado en la mono- y diubiquitilación no degradativa de Mcwc-1b, resultando en su inactivación. La existencia de tres genes mcwc-1 y los fenotipos observados de sus mutantes apoyan la sucesiva duplicación de los genes tipo wc-1 postulada en cigomicetos, seguida de una especialización de sus funciones permitida por la aparición de las nuevas copias. Title: Regulation of Light Responses in the Fungus Mucor circinelloides Introduction Light regulates many developmental and physiological processes in a large number of organisms. Most light responses studied in fungi require blue-light photoreceptors similar to Wc-1 of Neurospora crassa. The best-known light response in the fungus Mucor circinelloides is the biosynthesis of ?-carotene. In this organism, CrgA, a protein that shows characteristics of ubiquitin ligases, represses carotenogenesis in the dark and affects also other cellular processes, like sporulation or vegetative growth. Objectives The main goal of this thesis was to study light transduction pathways in fungi, specifically photocarotenogenesis and phototropism responses, using M. circinelloides as a model. The main objective was divided in the following specific objectives: 1. Identification and isolation of wc-1 genes in M. circinelloides. 2. Characterization of photocarotenogenesis and phototropic responses. 3. Generation of knockout mutants of each wc-1 gene in M. circinelloides and analysis of their phenotypes. 4. Generation of double knockout mutants of crgA and each wc-1 gene and analysis of their phenotypes. Methods The most complete molecular toolset in zygomycetes is available in M. circinelloides. The photocarotenogenesis response has been studied in this organism and there are several mutants available in structural and regulatory genes of the biosynthesis of carotenes. A bacteriophage ? genomic library of M. circinelloides and Southern blots were used to identify and clone the three wc-1 genes of M. circinelloides (mcwc-1). To characterize mcwc-1a, mcwc-1b and mcwc-1c and to study their relationships with crgA, simple and double (crgA?) knockout mutants for each mcwc-1 gene were generated. Phototropism of sporangiophores and ?-carotene content in the mycelium were analysed. Changes in the level of mRNAs in response to light of carotenogenic genes and of mcwc-1 genes were also studied by Northern blots. In addition, the expression levels of Mcwc-1b, its post-translational modifications and it possible interaction with CrgA were analysed using Western blots and co-immunoprecipitation. Conclusions Here, we show that M. circinelloides sporangiophores exhibit a positive phototropism. Analysis of light responses to different light wavelengths within the visible spectrum demonstrated that phototropism is induced by green and blue light, whereas carotenogenesis is only induced by blue light. Three white-collar-1 genes (mcwc-1a, mcwc-1b and mcwc-1c), coding for proteins showing similarity with the Wc-1, were identified in this thesis. All three contain a LOV (light, oxygen or voltage) domain, similar to the one present in fungal and plant blue-light receptors. The study of the knockout mutants for each mcwc-1 gene, showed that mcwc-1c is involved in the light transduction pathway that controls carotenogenesis and that positive phototropism is controlled by mcwc-1a gene. It seems therefore that mcwc-1a and mcwc-1c genes control different light transduction pathways, although cross-talk between both pathways probably exists, because mcwc-1a is involved in the light regulation of mcwc-1c expression. Analysis of double knockout mutants crgA? mcwc-1? showed that the effect of crgA on carotenogenesis is mediated by mcwc-1b, which acts as a carotenogenesis activator. Finally, it was demonstrated that CrgA is involved in the proteolysis-independent mono- and di-ubiquitylation of Mcwc-1b, which results in its inactivation. The existence and characteristics of the three mcwc-1 genes and the phenotypes of their knockout mutants support the successive duplication of the wc-1 like genes hypothesized in zygomycetes, followed by the functional specialization allowed by the presence of several copies.