Caracterización de las glicosidasas en el espermatozoide y su papel en la fecundación, con especial énfasis en la especie porcina

Resumen

El reconocimiento y la union inicial de los espermatozoides a la superficie de la zona pelucida (ZP) es un importante evento que precede a la penetracion del espermatozoide en el ovocito. Aunque la naturaleza quimica de las moleculas complementarias no es del todo conocida, se han encontrado evidencias que sugieren que algunas fases del proceso de fecundacion estan mediadas por carbohidratos en diferentes especies (Benoff, 1997; Tulsiani, 2000; Wassarman et al., 2005; Shur, 2008, Visconti, et al., 2010), En las especies bovina y porcina se ha comunicado la presencia de glicosidasas ligadas a los espermatozoides (Hayashi et al., 2004). Otros autores han propuesto diferentes glicosidasas espermaticas que interactuan con carbohidratos especificos en la ZP en otras especies animales incluyendo al hombre (Tulsiani et al., 1989, 1990; Aviles et al., 1996; Song et al., 2000; Venditti et al., 2007, 2010). En el presente trabajo se llevo a cabo un estudio de las principales glicosidasas espermaticas para establecer su ubicacion en el espermatozoide, el origen de su sintesis, la expresion genica y mediante FIV porcina valorar el papel de aquellas glicosidasas con mayor actividad enzimatica (AE) en el reconocimiento de gametos, fecundacion y desarrollo embrionario temprano. A continuacion, se describen de forma breve, los experimentos realizados y los resultados y conclusiones obtenidas: 1. Analisis y cuantificacion de las glicosidasas presentes en los espermatozoides porcinos y de mono (Macaca fascicularis). ¿¿-D-manosidasa y ¿¿-L-fucosidasa fueron las glicosidasas que expresaron una mayor AE, mientras que ¿À-D-glucosaminidasa y ¿À-Dgalactosaminidasa, en orden decreciente, fueron las que presentaron una menor AE en espermatozoides eyaculados, capacitados, reaccionados y epididimarios. No se detecto en condiciones fisiologicas AE para ¿¿-D-galactosidasa, ¿À-D-galactosidasa y neuraminidasa en espermatozoides porcinos. Por primera vez, se ha determinado la AE para ¿¿-D-manosidasa y ¿¿-L-fucosidasa en espermatozoides epididimarios de mono (Macaca fascicularis). 2. Estudio bioquimico de ¿¿-L-fucosidasa en espermatozoides porcinos y de mono. El peso molecular (PM) para ¿¿-L-fucosidasa espermatica porcina y de mono se determino mediante electroforesis en condiciones reductoras (SDS PAGE y Western blot), en espermatozoides eyaculados y capacitados, obteniendose un PM de 50-52 kDa para el cerdo y de 48-50 kDa para el mono. La inmunolocalizacion de ¿¿-L-fucosidasa en espermatozoides eyaculados, capacitados, sometidos a RA, epididimarios y testiculares en 2 la especie porcina, mediante el anticuerpo anti-¿¿-L-fucosidasa humana, demostro que esta enzima se localiza sobre la region acrosomal de la cabeza del espermatozoide porcino, a nivel de la membrana plasmatica. 3. Analisis y caracterizacion de la expresion genica de ¿¿-L-fucosidasa tipo1 (FUCA1) y ¿¿-L-fucosidasa tipo2 (FUCA2) en el tejido testicular porcino. Hasta el presente trabajo, FUCA1 porcina no habia sido identificada, por lo que, su secuencia de nucleotidos y aminoacidos ha sido recientemente registrada y publicada en la base de datos GenBank con su numero de referencia (JF932294.1) (htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JF932294.1), como parte de los resultados de esta Tesis Doctoral. Por lo tanto y en conclusion, el ARNm que codifica para la enzima ¿¿-L-fucosidasa tipo 1 (FUCA1) y ¿¿-L-fucosidasa tipo 2 (FUCA2) se encuentran presente en el testiculo porcino. 4. Evaluacion del papel de las glicosidasas espermaticas en FIV porcina. Se realizaron los ensayos de maduracion in vitro (MIV) y FIV con el uso de los inhibidores de las glicosidasas, para analizar la interaccion espermatozoide-ZP. El uso del inhibidor especifico para ¿¿-D-manosidasa y el analisis del grado de union de espermatozoides a la ZP nos indican que esta enzima espermatica participa, posiblemente, en el reconocimiento primario de los gametos en la especie porcina. El uso del inhibidor para ¿¿-L-fucosidasa espermatica y el analisis del grado de union de espermatozoides a la ZP nos revelan que esta enzima podria participar en el reconocimiento primario de los gametos. Adicionalmente, la utilizacion del inhibidor especifico mejoro el porcentaje de monospermia de los cigotos, por lo que posiblemente, ¿¿-L-fucosidasa espermatica porcina podria tener una funcion en la interaccion de la membrana espermatica con el oolema y estar involucrada en los mecanismos de fusion del embrion. La utilizacion de los inhibidores especificos para ¿¿-D-manosidasa y ¿¿-L-fucosidasa espermaticas no ocasionaron una mejora en el numero y calidad de los blastocistos producidos durante el desarrollo embrionario in vitro.