Avances sobre el transporte de calcio en el reticulo sarcoplasmicocaracterizacion de dominios estructurales y funcionales de la calcio-atpasa

Resumen

Al tratarse de una proteína de membrana la Ca2+-ATPasa es una proteína difícil de estudiar. En el trabajo realizado en esta Tesis Doctoral se ha profundizado en el conocimiento de diferentes aspectos estructurales y funcionales de la proteína que son importantes para llegar a conocer el mecanismo molecular de la misma. Utilizando para ello diferentes técnicas. Uno de los estudios se ha centrado en la localización de los centros de unión de calcio de la proteína utilizando para ello la sonda fluorescente NCD-4, ya que esta se une fuertemente al centro de unión de calcio de alta afinidad en la proteína. Mediante estudios de atenuación de fluorescencia se ha localizado esta sonda a 16,5 A desde el centro de la bicapa lipídica. También se ha realizado la localización de la misma en la proporción transmembranal de la proteína, concretamente en el segmento Leu253-Glu309, señalando este residuo de glutámico como posible diana para el NCD-4. Todos estos resultados nos indican que el dominio de unión de calcio se encuentra localizado próximo a la superficie de la membrana pero en un entorno hidrofóbico. Otro de los estudios llevados a cabo ha sido la caracterización cinética de la modificación de la proteína por fenilmaleimida, que es un compuesto que reacciona con residuos de cisteína de las proteínas. La unión de este compuesto a la proteína la inhibe fuertemente, siguiendo una cinética de pseudo-primer orden, inhibiendo la transferencia de fosfato del ATP a la enzima para formar un intermedio fosforilado, indicando que la unión debe producirse en un residuo de cisteína próximo al sitio de fosforilación por lo que la Cys377 y la Cys349 podrían ser buenos candidatos para reaccionar con fenilmaleimida. Caracterización cinética de la modificación de la ATPasa por el ácido maleimidilsalicílico, así como localización del aminoácido marcado por ese compuesto en la Ca2+-ATPasa. La unión de este