Caracterizacion molecular y funcional del factor de necrosis tumoral a de dorada (sparus aurata, l)

Resumen

Durante el desarrollo de la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo la caracterización del factor de necrosis tumoral (TNFa) de dorada (Sparus aurata L). Nuestro trabajo se ha elaborado en tres etapas. En una primera etapa se abordó la clonación del gen del TNFa de dorada mediante una aproximación por clonación homóloga utilizando RT-PCR. El cDNA del TNFa de dorada contiene 1.359 pares de bases (pb) que incluyen un marco de lectura abierta de 762 pb, un extremo 5' no traducido (UTR) de 142 pb y un extremo 3' UTR de 455 pb. El gen está compuesto por 4 exones y 3 intrones. La proteína posee un alto grado de homología con otros TNFa de peces, encontrándose la mayor homología con las secuencias de la dorada de cabeza negra y el pargo japonés. El gen del TNFa se expresa de forma constitutiva en diferentes órganos, implicados o no en la respuesta inmmune, tanto en peces control como infectados experimentalmente con la bacteria Vibrio anguillarum. Las proteínas TTP humana y de pez cebra son capaces de interaccionar con las secuencias AREs de la región 3¿ no traducida del mRNA del TNFa de dorada, lo que sugiere la existencia de un mecanismo de regulación post-transcripcional del TNFa en peces. En la segunda etapa del estudio, se obtuvo el TNFa recombinante de dorada, así como anticuerpos policlonales específicos. El TNFa de dorada en disolución es mayoritariamente homodimérico, a diferencia del TNFa de mamíferos que es un homotrímero. In vitro, el TNFa de dorada es capaz provocar proliferación de leucocitos de riñón cefálico de dorada de forma dosis dependiente, siendo bloqueado este efecto por el anticuerpo desarrollado en este trabajo. In vivo, una inyección intraperitoneal de 10 mg de TNFa de dorada produce un aumento en la explosión respiratoria de los leucocitos de exudado peritoneal y riñón cefálico y un rápido reclutamiento de granulocitos al sitio de la inyección, siendo ambas actividades típicas d