Caracterizacion estructural y funcional de la 5'-nucleotidasa de musculo de raton

Abstract

1. En la presente memoria doctoral se purifico la 5'-nt mediante la extraccion secuencial del musculo esqueletico de raton. Se obtuvo una fraccion soluble rica en actividad ampasa. 2. Luego se purifico la 5'-nt del extracto, obteniendose tres preparaciones: nr=ampasa no retenida en la matriz con amp; nt-i= enzima eluida con beta gp; nt-ii = ampasa ligada a la matriz y liberada con amp. 3. La enzima se ha purificado unas 200 veces en nt-i, y 7800 en nt-ii. 4. Nt-ii reacciona con anticuerpos generados contra la ent de plasma seminal bovino. Las subunidades de 5'-nt de musculo presentan masas moleculares de 74, 65 y 52 kda. 5. La actividad ampasa es 5'-nucleotidasa, como lo demuestra su caracter glicoproteico, afinidad por amp, inhibicion por alfa, beta-metilenadenosina- 5'-difosfato, e interaccion con anticuerpos. 6. Los valores de los coeficientes de sedimentacion de las formas enzimaticas y su variacion con el detergente añadido al gradiente indican que la fraccion nr es rica en dimeros hidrofilicos, mientras que las fracciones nt-i y nt-ii contienen, principalmente, formas dimeras anfifilicas. 7. Las propiedades hidrofilicas de la 5'-nt en nr, y anfifilicas en nt-i y nt-ii, quedan confirmadas por los resultados de la particion de fases con triton x-114 y cromatografia de afinidad en fenil-agarosa. La incubacion con fosfolipasa c especifica para los fosfolipidos del inositol demuestra que la enzima contiene restos de glicosil-fosfatidil inositol. 8. La enzima contiene cinc fuertemente unido, con una estequiometria de 2,2 atomos por cada molecula dimera. Probablemente el metal esta implicado en la catalisis, ya que la enzima se inhibe con edta e imidazol. La 5'-nt inhibida con imidazol recupera la actividad al añadir zn2+, mn2+, o mg2+. 9. La ent de musculo de raton hidroliza con preferencia ump, muestra una km para el amp de 12 m y se inhibe de modo competitivo por adp y atp. 10. Los analisis de sedimenta