Implicación de los receptores similares a toll (tlrs) en la respuesta inmunitaria innata de teleósteos

Resumo

Durante el desarrollo de la presente Tesis Doctoral se ha estudiado la respuesta inmunitaria innata de dorada en lo que se refiere asus principales receptores, los receptores similares a Toll (TLRs) y los ligandos de ?stos. Nuestro trabajo se ha elaborado en tres etapas. En una primera etapa se abord? la caracterizaci?n molecular y el patr?n de expresi?n del tlr5 soluble y el tlr22 de dorada, genes identificados y clonados en el presente trabajo. Adem?s, se estudi? la expresi?n del tlr9, gen que hab?a sido identificado previamente. El cDNA del TLR5S contiene 3.252 nucle?tidos (nt) que incluyen un marco de lectura abierta de 1.938 nt, un extremo 5' no traducido (UTR) de 46 nt y un extremo 3' UTR de 1.271 nt. La secuencia de sus amino?cidos posee un alto grado de homolog?a con otros TLR5S (del 67% al 79%), as? como con el TLR5 de membrana (TLR5M) de peces (del 44% al 52%), encontr?ndose la mayor homolog?a con las secuencias de Takifugu rubripes. El cDNA del TLR22 contiene 4.501 nt que incluyen un marco de lectura abierta de 2.895 nt, un extremo 5' no traducido (UTR) de 164 nt y un extremo 3' UTR de 1.442 nt. La secuencia posee un alto grado de homolog?a a nivel de amino?cidos con otros TLR22 de peces (del 60% al 69%), encontr?ndose tambi?n la mayor homolog?a con las secuencias de Takifugu rubripes. Adem?s, el TLR22 de dorada posee una alta homolog?a con las prote?nas TLR11 y TLR13 de rat?n. El an?lisis de la expresi?n de estos TLRs en animales sanos muestra una mayor expresi?n de tlr5s en el h?gado y en el exudado peritoneal comparado con el resto de tejidos. Sin embargo, la expresi?n del tlr22 y del tlr9 en el h?gado es considerablemente menor que en el resto de muestras analizadas. La infecci?n experimental con Vibrio anguillarum induce un aumento considerable en los niveles de mRNA del tlr5s y en menor medida en los del tlr22 y el tlr9. Sin embargo, la infecci?n experimental con nodavirus induce un leve aumento en los niveles de mRNA del tlr5s en ri??n cef?lico, mientras que en el cerebro, ?rgano diana de este virus, no se observan cambios significativos. La inducci?n del tlr22 y el tlr9 por nodavirus es menor que la del tlr5s, no produci?ndose cambios en la expresi?n del tlr9 en ri??n cef?lico. En la segunda etapa del estudio, se analiz? el efecto in vitro de los ligandos de diferentes TLRs, denominados PAMPs (patrones moleculares asociados a pat?genos), en diferentes actividades propias de los fagocitos de dorada: la explosi?n respiratoria, la producci?n de citoquinas y las actividades fagoc?tica y bactericida. Los resultados muestran un aumento en la explosi?n respiratoria y en las actividades fagoc?tica y bactericida de los granulocitos acid?filos de dorada tras ser estimulados con DNA gen?mico de V. anguillarum (VaDNA), flagelina, lipopolisac?rido (LPS) y muramildip?ptido (MDP). El poli I:C induce la explosi?n respiratoria de los granulocitos de forma indirecta cuando son estimulados con el resto de c?lulas que componen el ri??n cef?lico. El an?lisis de expresi?n de citoquinas muestra que tanto los macr?fagos como los granulocitos acid?filos responden a diferentes PAMPs mediante la producci?n de citoquinas proinflamatorias y prostanoides inflamatorios, a trav?s de la inducci?n de cox-2, con cin?ticas diferentes. Adem?s se observa un aumento en los niveles de mRNA del tlr5s, tlr22 y tlr9 en los fagocitos de dorada estimulados con diferentes PAMPs con una cin?tica similar a la de las citoquinas. La ?ltima etapa del presente trabajo se centr? en el estudio del reconocimiento de LPS en peces y la posible implicaci?n del TLR4 de pez cebra. Tanto los leucocitos de dorada como los de Tetraodon, que carece de TLR4, fueron capaces de responder a preparaciones ultra puras de LPS de E. coli mediante la producci?n de citoquinas. Estudios realizados en pez cebra muestran la expresi?n ubicua del tlr4a en todos los tejidos analizados, mientras que el transcrito del tlr4b no se detecta en h?gado, cerebro, branquia y ojo, tejidos en los que la expresi?n del tlr4a es mayor. Adem?s la inyecci?n intramuscular de LPS de E. coli en pez cebra, induce la expresi?n de genes dependientes de MyD88, pero no de genes dependientes de TRIF. Sin embargo la expresi?n ect?pica del TLR4a y el TLR4b en c?lulas HEK293 no confiere sensibilidad a LPS. Estudios realizados en embriones de pez cebra revelan que morfolinos para el TLR4a, el TLR4b y MyD88 de pez cebra no ejercen efecto alguno sobre la activaci?n de NF- B inducida por LPS. Adem?s el dominio TIR del TLR4b reduce la activaci?n de NF- B tanto basal, como la inducida por el TIR humano o por VaDNA. Estos resultados sugieren que el TLR4 no est? implicado en el reconocimiento del LPS en los peces.