Caracterización de la actividad biológica del factor de necrosis tumoral (alfa) de teleósteos

Resumen

Durante el desarrollo de la presente Tesis Doctoral se ha estudiado la regulación post-transcripcional de las citoquinas interleuquina-1 (IL-1 ) y factor de necrosis tumoral (TNF ) de peces, así como la actividad biológica del TNF de peces y su papel durante el curso de una infección experimental. Además, hemos identificado al gen del receptor del factor estimulante de colonias de macrófagos (mcsfr) como un marcador de macrófagos de dorada. Una producción desmesurada de citoquinas pro-inflamatorias, tales como IL-1 y TNF , desencadena los efectos patológicos observados en muchas enfermedades inflamatorias causadas por endotoxinas bacterianas. Por este motivo, la síntesis de estas citoquinas está finamente regulada tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional. La regulación post-transcripcional de la expresión génica depende de secuencias que actúan en cis y factores que lo hacen en trans. Así, la presencia de elementos ricos en adenina y uracilo (AREs) ha sido descrita en la región no traducida del extremo 3' (3'UTR) de muchos mRNAs de mamífero. A pesar de que las secuencias ARE están ampliamente representadas en la escala evolutiva y representan el más variado y eficaz determinante de la estabilidad de los mensajeros caracterizados en células de mamífero (Bevilacqua y col., 2003), no hay estudios disponibles sobre la relevancia funcional de estas secuencias en vertebrados no mamíferos. En este estudio, se determinó la actividad enzimática de varias construcciones con el gen chivato de la luciferasa, conteniendo o no las regiones 3'UTR de las citoquinas IL-1 y TNF de diferentes especies de peces, y se demostró que las secuencias ARE de peces son capaces de reducir la actividad luciferasa, aunque de forma menos dramática que sus equivalentes en mamíferos. Sorprendentemente, el 3'UTR de la IL-1 de la pintarroja, un pez cartilaginoso, tuvo la máxima capacidad de reducir la actividad luciferasa. Posteriormente, la relevancia funcional de estos resultados fue confirmada mediante la determinación de la vida media de los mRNAs de la IL-1 y del TNF en leucocitos de dorada mediante el bloqueo de la transcripción con actinomicina D. Ambos mRNAs fueron inestables con una vida media estimada de unos 45 minutos tanto en leucocitos control como activados. Posteriormente se llevó a cabo la clonación molecular del gen del receptor del factor estimulante de colonias de macrófagos de dorada (sbM-CSFR) como candidato a ser un marcador de monocitos/macrófagos, una población leucocitaria de gran importancia desde el punto de vista de la producción de TNF , así como de ser diana celular de esta citoquina. El péptido deducido de la secuencia de nucleótidos presentó un péptido señal, un dominio transmembrana y otro tirosina kinasa, todos ellos en posiciones conservadas respecto a los M-CSFRs de otras especies. Se encontró un transcrito con un codón prematuro de fin de la traducción, lo que predijo la pérdida de los 84 residuos del extremo carboxilo terminal. Los estudios de expresión mediante RT-PCR demostraron que, a pesar de encontrar expresión del sbM-CSFR en diferentes tejidos u órganos inmunitarios, incluyendo branquias, hígado, bazo, sangre, exudado peritoneal, timo y riñón cefálico, su expresión está relegada al linaje de los monocitos/macrófagos. Además, la expresión del sbM-CSFR podría estar modulada por el estado de activación de los macrófagos, ya que tanto en peces infectados con Vibrio anguillarum como en leucocitos estimulados in vitro, apareció una disminución de la expresión de dicho gen. Por tanto, el M-CSFR podría ser utilizado como marcador del linaje de monocitos/macrófagos de dorada, una especie utilizada como modelo inmunitario y de gran interés en acuicultura. Además, la caracterización funcional del sbM-CSFR y su ligando podría iluminar los mecanismos de proliferación y las vías de diferenciación de macrófagos en teleósteos. Finalmente, se estudió la actividad biológica del TNF , así como el papel que juega esta citoquina durante el transcurso de un proceso inflamatorio. El TNF es la principal citoquina pro-inflamatoria liberada por algunas células inmunitarias durante una infección o daño tisular y está implicada en un amplio rango de condiciones inflamatorias, infecciosas y de malignidad. El TNF se presenta en dos formas, una forma anclada a la membrana plasmática y otra soluble, cada una con su propio y distinto papel fisiológico. El TNF ejerce sus efectos mediante la unión, en forma de trímero, a dos receptores de membrana, denominados TNFR1 y TNFR2, ambos expresados de forma ubicua en la mayoría de las células. Recientes estudios con ratones deficientes han mostrado que el TNFR1 media predominantemente apoptosis así como efectos pro-inflamatorios, mientras que el TNFR2 media señales que promueven reparación tisular y angiogénesis. Por esta razón, el TNF de mamíferos ha sido denominado una espada de doble filo, porque induce tanto migración celular, proliferación, supervivencia y diferenciación o muerte celular. Probablemente, una de las principales funciones del TNF es la regulación de las interacciones entre el endotelio que conforma los vasos y los leucocitos circulantes a través de la inducción de moléculas de adhesión en el endotelio. Los resultados obtenidos en le presenta trabajo demostraron que la principal diana celular del TNF en peces es la célula endotelial, mientras que los macrófagos son débilmente activados por esta citoquina. Los efectos del TNFa de peces en la célula endotelial incluyen la producción de citoquinas pro-inflamatorias y quimioquinas, y la inducción de moléculas de adhesión, moléculas presentadoras de antígeno y de receptores similares a toll (TLRs). Además, se demostró que el TNF aumenta la susceptibilidad de peces cebra al virus de la viremia primaveral de la carpa y a la bacteria Streptococcus iniae.