Clonatge, expressió i caracterització de la lipoxigenasa de pseudomonas aeruginosa 42º2

Resumen

Las lipoxigenses son una familia de enzimas que se encuentran en mamíferos y vegetales de forma habitual en diversos tejidos. También se han empezado a describir en organismos inferiores y últimamente en algunos microorganismos. La lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginosa es la primera lipoxigenasa descrita en procariotas. Son enzimas que transforman los ácidos grasos en derivados hidroxilados. El uso de enzimas esta cada vez mas extendido a nivel industrial, con el objetivo de transformar substratos o bien para obtener productos con elevada especificidad. Este és el objetivo de esta tesis doctoral, clonar y sobre expresar la lipoxigenasa de Pseudomonas aeruginasa en E. Coli, en cantidades suficientes con tal de obtener derivados hidroxilados de los ácidos grasos gracias a la transformación por parte de la lipoxigenasa. Este estudio se encuentra enmarcado dentro del proyecto CTQ-0771-CO2-01/PPQ. Se han generado y purificado diferente formes de la proteína recombinante mediante tecnologías del DNA recombinante. Una de estas proteínas recombinantes se ha caracterizado determinando el espectro de substratos (siendo activa hacia el ácido araquidónico, linoleico, linolenico i oleico), les condiciones de reacción tales como ara pH optimo (variable dependiente del substrato en tre 6 i 8), la temperatura óptima de reacción (25C)i la estabilidad térmica (activa hasta los 50C). Se han determinado las inhibición por producto, substrato existente i les constantes cinéticas (K M, Vmax, Kcat, i la eficiencia catalítica) juntamente con la influencia del etanol en la actividad enzimática. També se han realizado los estudios previos para realizar un escalado del proceso de producción de derivados monohidroxilados determinando los principales parámetros de la biotransformación, tales como el tiempo de reacción, la concentración de substrato i la influencia de la aireación en la transformación de los ácidos grasos.