Efecto de la hipertensión ocular en la población de células ganglionares de la retina de rata y ratón

Resumen

Esta tesis se compone de dos partes: El estudio completo de la población de las células ganglionares de la retina (CGR) en rata y ratón, y el desarrollo de un modelo experimental de hipertensión ocular (HTO) en rata y ratón para estudiar los mecanismos por los cuales la HTO causa daño en la población de CGR. Introducción La población de CGR en roedores se utiliza para investigar las respuestas degenerativas y regenerativas de las neuronas del sistema nervioso central (SNC) a diferentes neuropatías, así como para ensayar las propiedades neuroprotectoras de distintas sustancias. En este trabajo hemos realizado el análisis detallado tanto cuantitativo como topográfico, de la población total de CGR en animales control. Estos datos serán la base para analizar el curso temporal de degeneración de estas neuronas después de un determinado insulto y la supervivencia de las mismas tras un tratamiento neuroprotector. La neuropatía óptica glaucomatosa (NOG) es una de las enfermedades oculares neurodegenerativas más frecuentes. Se caracteriza por la pérdida paulatina de la capa de fibras nerviosas de la retina (CFNR) que sin tratamiento puede evolucionar a la completa ceguera. El factor de riesgo más importante es el aumento de la presión intraocular (PIO). Las causas por las cuales la NOG causa daño en la población de CGR no son bien conocidas. Para intentar comprender estos mecanismos hemos utilizado un modelo experimental de NOG en rata y en ratón, inducido por el aumento de la PIO. Objetivos Identificar las CGR en roedores usando técnicas de trazado axonal retrógrado. Poner a punto un método automatizado de contaje de CGR trazadas. Analizar cualitativa y topográficamente la población de CGR retinotectales y retinofugales. Analizar cualitativa y topográficamente la población de CGR que proyectan ipsilateralmente y contralateralmente. Desarrollar un modelo experimental de HTO en rata y ratón albinos. Caracterizar los efectos del aumento de la PIO en la población de CGR y en sus axones. Materiales y métodos En este trabajo se han utilizado ratas hembras adultas de 2 estirpes diferentes, una albina (Sprague-Dawley (SD)) y una pigmentada (Piebald Virol Glaxo (PVG) Brown Norway) y ratones machos adultos de dos estirpes, una albina (Swiss) y la otra pigmentada (C57BL/6N). Se realizaron distintos grupos experimentales organizados según las manipulaciones experimentales llevadas a cabo. Para identificar la población total de CGR retinotectales de rata y ratón, una semana antes del procesado del animal se aplicó en la superficie de ambos colículos superiores (CS) el trazador neuronal fluorescente fluorogold (FG) o hidroxistilbamidina metanosulfonato (OHSt) respectivamente. Para identificar la población total de CGR retinofugales se aplicó el trazador en la superficie del muñón del nervio óptico (MNO) intraorbitario proximal al globo ocular 3 días antes del procesado. Para identificar la población total de CGR que proyectan su axón ipsilateralmente y contralateralmente, se realizó la coliculectomía de un CS, se aplicó FG en el CS contralateral una semana después de la coliculectomía y una antes del procesado del animal. Para desarrollar el modelo experimental de HTO en rata y ratón, se realizó la fotocoagulación por láser diodo (FL) de la malla trabecular, las venas perilimbares y episclerales en rata albina SD y ratón albino swiss, del ojo izquierdo experimental dejando el derecho como control. El tamaño del punto, duración, potencia y número de disparos fueron, respectivamente: 50-100µm, 0.5s, 0.4W y 90 disparos en rata y 50-100µm, 0.5s, 0.3W y 72 disparos en ratón. Para determinar el número idóneo de disparos láser para aumentar la PIO en rata, se realizó un primer grupo que se dividió en dos subgrupos 1.1 y 1.2, que recibieron 65-70 u 85-90 disparos, respectivamente. Para los experimentos de HTO se realizaron varios grupos experimentales organizados según el objetivo y la duración del periodo de estudio después del tratamiento con láser (8, 14, 21 días, 8 y 12 semanas en rata y 8, 17 días, 5 y 9 semanas, en ratón). Para estudiar el efecto de la FL en la PIO y su evolución a lo largo del tiempo, se midió la PIO en rata con el tonómetro de contacto y en ratón con el tonómetro de rebote. En rata se realizaron registros antes de y a 6, 12, 24, 48, 72 horas y 1, 2, 3, 4 ó 12 semanas después de la FL. Y en ratón antes de y a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 14, 21, 28, 42, ó 56 días después del tratamiento con láser. Para estudiar el efecto de la HTO en el transporte axonal retrógrado (TAR) activo se aplicó FG u OHSt en ambos CS de rata o ratón respectivamente, 7 días antes del procesado del animal. Para estudiar el TAR por difusión se aplicó el trazador neuronal dextrano tetrametilrodamina (DTMR) en el MNO 5 días después de la aplicación del FG o el OHSt y 2 días antes del procesado del animal. Para estudiar la población de CGR que sobreviven después de la HTO, se realizaron dos experimentos: Marcaje retrógrado de las CGR una semana antes de la FL y posterior marcaje en el MNO con DTMR. Inmunodetección del Brn3a, que es un factor de transcripción específico de las CGR, en las retinas previamente marcadas con FG u OHSt. Para estudiar el efecto de la HTO en los axones intrarretinianos de las CGR que forman la Capa de Fibras Nerviosas de la Retina (CFNR) y en los axones que forman la cabeza del NO, se inmunodetectó la subunidad pesada fosforilada de los neurofilamentos (pNFH) tanto en las retinas a plano como en las secciones transversales del NO. Para estudiar el efecto de la HTO en la astroglía de la cabeza del NO se inmunodetectó la proteína acida fibrilar glial (GFAP) en las secciones transversales del NO. Para estudiar el efecto de la HTO en todos los tipos de células que componen la capa de CGR, en retinas completas control y experimentales se tiñeron todos los núcleos con DAPI, y se inmunodetectó el Brn3a para identificar las CGR. Todas las muestras fueron examinadas y fotografiadas bajo un microscopio de fluorescencia equipado con una platina motorizada controlada por un sistema de análisis de imagen: Image-Pro Plus¿ (IPP 5.1 para Windows¿; Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA). Para hacer reconstrucciones de las retinas completas se capturaron imágenes individuales de forma secuencial y no solapada comprendiendo toda la superficie de la retina y posteriormente fueron unidas para formar el fotomontaje de la retina completa. Las imágenes digitales individuales, tanto de FG como de Brn3a, fueron procesadas por una serie de rutinas específicas para cada marcador y especie, desarrolladas con el programa de análisis de imagen IPP para realizar el contaje automático. Los datos cuantitativos obtenidos de cada retina, se usaron para generar los correspondientes mapas de isodensidad de las CGR. Resultados La media del número total de CGR retinofugales marcadas desde el NO en rata albina y pigmentada fue 82.818±3.949 (n=27) fue 89.241±3.576 (n=6), respectivamente La media del número total de CGR retinotectales marcadas desde el CS en rata albina y pigmentada fue de 81.486±4.340 (n=37) y 87.229±3199 (n=59), respectivamente. La media del número total de CGR marcadas desde el NO sin seccionar en ratas SD fue de 85.063±1.330 (n=5). La media del número total de CGR retinofugales marcadas desde el NO en ratón albino fue de 49.493±3.936 (n=18) y en pigmentado fue de 42.658±1.540 (n=10). La media del número total de CGR retinotectales marcadas desde el CS en ratón albino fue de 48.733±3.954 (n=43) y en pigmentado fue de 41.192±2.821 (n=42). Tanto en rata como en ratón, la población de CGR retinofugal fue mayor que la retinotectal, aunque esta diferencia no fue significativa. La media del número total de CGR que proyecta su axón ipsilateralmente en rata albina fue de 2.103±270 (n=12) y en pigmentada fue de 3.600±371 (n=9). Constituye el 2,5% y el 4,2% de la población retinotectal de CGR trazadas retrógradamente (CGR-FG+) en ratas SD y PVG, respectivamente. En los mapas de isodensidad se observó que la mayor densidad de CGR se encuentra en una región aproximadamente a 1mm por encima del disco óptico, extendiéndose horizontalmente a lo largo del eje naso-temporal adoptando la forma de una estría visual, dentro de la cual los valores más altos se localizan en la zona superotemporal de la retina. Desde esta región de alta densidad, las densidades de CGR decrecen rápidamente hacia la periferia de la retina dorsal y ventral. Esta disminución es más pronunciada en la retina dorsal. Esta distribución de las CGR se repite en rata y en ratón. Las CGR ipsilaterales al CS trazadas retrógradamente con FG (CGRip-FG+) se distribuyen mayoritariamente en la periferia de la retina temporal adoptando la forma de luna creciente. La densidad de CGRip-FG+ aumenta desde la zona inferior hasta la superior, localizándose la región de más alta densidad superotemporalmente. En el subgrupo 1.1, donde no hubo un aumento de la PIO, no se observó degeneración axonal en la cabeza del NO ni pérdida de CGR, mientras que en el subgrupo 1.2, donde aumentó la PIO, se observó en el nervio óptico una disminución en sectores de la expresión de pNFH y un aumento en la expresión de la GFAP en estos sectores, que tuvo correspondencia con la pérdida de CGR. Después de la FL, en rata hubo un aumento de la PIO con un máximo de aproximadamente dos veces los valores iniciales a las 12h. A partir de este momento, la PIO decreció lentamente hasta estabilizarse a las 3 semanas, permaneciendo por encima de los valores basales hasta el último punto temporal analizado (12 semanas). En ratón hubo un aumento de la PIO dos veces los valores basales a las 24h que persistió hasta el 4º día, momento en el que empezó a descender gradualmente alcanzando los valores basales a la semana. En rata, la pérdida de marcaje retrógrado se observó a los 8 días después de la FL. La pérdida principal de CGR-FG+ ocurre entre 8 días (38.397±12.306 (n=6)) y 2 semanas (15.251 ±18.729 (n=8)) después de la FL y a partir de las 2 semanas no progresó con el tiempo (18.149±20.383 (n=34, 3 semanas), 15.727±16.468 (n=41, 8 semanas) y 18.686±16.487 (n=14, 12 semanas)). Esto supone una población de CGR-FG+ respecto a la de su ojo no tratado del 46%, 19%, 23%, 21% y 24% a 8d, 2, 3, 8 y 12 semanas después de la FL, respectivamente. En ratón la pérdida de marcaje retrógrado se observó a los 8 días después de la FL y no progresó con el tiempo (13.428±6.295 (n=12, 8 días), 10.456±14.301 (n=13, 17 días), 12.622±14.174 (n=21, 5 semanas) y 10.451±13.949 (n=13, 9 semanas). Esto supone una población de CGR-OHSt+ respecto al ojo no tratado del 28%, 23%, 26% y 22% a 8, 17, 35, y 63 días después de la FL, respectivamente. La ausencia de TAR durante las dos primeras semanas se debe a un daño en el TAR activo que es seguido por un daño en el TAR pasivo, ya que se observó una correlación entre las áreas con CGR trazadas retrógradamente con FG ó con OHSt y las áreas con CGR-DTMR+, implicando una compresión de los axones cerca de la cabeza del NO. La ausencia de CGR trazadas retrógradamente se presentó preferentemente (en el 95% de los casos) en la retina dorsal, adoptando la forma de sectores con el ápice dirigido hacia el disco óptico. Se observó dos tipos de pérdida, una localizada con ninguna o muy pocas CGR trazadas retrógradamente y otra difusa, donde había una disminución en la densidad de las CGR. Se observó una clara discrepancia entre el número de CGR que sobreviven (CGR-FG+), marcadas antes de la FL y el menor número de CGR trazadas desde el MNO con DTMR. En otro experimento se observó a 8 días, que en las zonas desprovistas de CGR trazadas retrógradamente había muchas CGR supervivientes (CGR-Brn3a+), tanto en rata como en ratón (en rata: CGR-Brn3a+ 72.289±5431; (n=6) y CGR-FG+ 38.397 ±12.306; (n=6) y en ratón CGR-Brn3a+ 24.343±5.739; (n=12) y CGR-OHSt+ 13.428±6.295; (n=12)). El 47% y 45% de las CGR que sobreviven a 8 días post-FL, en rata y ratón respectivamente, no tienen funcional su TAR activo. A tiempos más largos (a 21 d y 35 d en rata y ratón respectivamente) no hay diferencias significativas entre el número de CGR marcadas retrógradamente y las células que sobreviven (en rata CGR-Brn3a+ (30.942±20.415; n=10) y CGR-FG+ (18.040±21.197; n=10) a 21 días; en ratón CGR-Brn3a+ (10.219±8.887; n=9) y CGR-OHSt+ (10.522±9.426; n=9) a 35 días). El daño del TAR es anterior a la degeneración de las CGR. La ausencia de CGR marcadas retrógradamente se debe a un daño en el TAR activo y a una degeneración de las CGR. En la CFNR se observaron, en las zonas desprovistas de CGR trazadas retrógradamente, signos de degeneración axonal retrógrada y somática de las CGR que consistieron en una expresión aberrante del pNFH en los axones y en los somas de las CGR, que fue más intensa a 17 y 21d post FL. La disminución de la densidad axonal sólo fue obvia a las 12 semanas post-FL. En las regiones lesionadas de retinas experimentales, había muy pocas CGR-Brn3a+ sin embargo, la proporción de células DAPI+/CGR-Brn3a+ era mayor que en las retinas controles, lo que indica que la HTO afecta específicamente a las CGR. Conclusiones. La población de CGR trazadas retrógradamente con FG u OHSt en rata o ratón respectivamente, puede ser contada automáticamente con un nivel de confianza comparable a los contajes manuales. El número total de CGR retinofugales es mayor que el de retinotectales, pero esta diferencia no es significativa, indicando la masiva proyección retinotectal del sistema retinofugal en ratas adultas. La población total de CGR retinofugales y retinotectales es mayor en ratas pigmentadas que en albinas y en ratones albinos que en pigmentados. La inmensa mayoría de la población de CGR decusa su axón a nivel del quiasma óptico; esta proporción es mayor en rata pigmentada que en albina. Las CGR se distribuyen dentro de la retina en un área orientada horizontalmente de alta densidad localizada en la retina dorsal parecida a una estría visual, dentro de la cual sus valores más altos se localizan en su zona superotemporal. La población de CGR ipsilaterales se distribuye mayoritariamente en la periferia de la retina temporal adoptando la forma de luna creciente, localizándose la región de más alta densidad superotemporalmente. La fotocoagulación de la malla trabecular, vasos perilimbares y episclerales induce un aumento de la PIO que causa eventos degenerativos en la retina y en el NO similares a los descritos en pacientes con glaucoma. Se produce un daño del TAR que se mantiene durante todo el periodo de estudio que afecta a aproximadamente al 75-80% de la población de CGR. El daño en el TAR primero es funcional y posteriormente mecánico. El daño en el TAR induce la degeneración y muerte progresiva de la población de CGR, por tanto la ausencia de CGR marcadas retrógradamente se debe a un daño en el TAR activo y a una verdadera muerte de las CGR. La ausencia de CGR tiene forma de sectores con su ápice dirigido hacia el disco óptico y se presenta preferentemente en la retina dorsal. Se observan dos tipos de pérdida, una localizada y otra difusa. La HTO induce una compresión de los axones de la cabeza del NO y conduce a la degeneración anterógrada y retrógrada de los axones de las CGR. Hay una pérdida selectiva de CGR en la capa de CGR, que indica que la causa de la muerte de las CGR por HTO se sitúa en la cabeza del NO y no se debe a una isquemia generalizada de la retina.