Determinación de la actividad enzimática poli-adp-Ribosa polimerasa en células del sistema inmune

Resumo

Existen numerosas evidencias de que la enzima Poli-ADP-ribosa polimerasa-1 (PARP-1) desempeña un importante papel en la modulación de la expresión génica durante el desarrollo y en respuesta a señales celulares específicas, ejerciendo su acción a diferentes niveles. PARP-1 pertenece a una familia de enzimas (PARP) que, usando NAD+ como sustrato, sintetizan y transfieren homopolímeros de ADP-ribosa en residuos de ácido glutámico en proteínas aceptoras principalmente involucradas en la estabilidad de la cromatina y en el metabolismo del DNA. La actividad de PARP-1, responsable de casi el 90% de la poli-ADP-ribosilación en las células, podría modular la expresión génica a través de la poli-ADP ribosilación de otras proteínas o por asociación física con proteínas relevantes como son los factores de transcripción. En este trabajo nos hemos centrado en poner a punto un método cuantitativo de medida de la actividad poli-ADP-ribosa polimerasa en células permeabilizadas utilizando 3H-NAD+ como sustrato. Durante su caracterización, el método ha demostrado tener una buena sensibilidad, precisión, especificidad y exactitud. Una vez optimizado, dicho método se ha empleado en el estudio de las reacciones de poli-ADP-ribosilación mediadas por las enzimas PARP en células del sistema inmune. El estudio de la actividad PARP en timocitos procedentes de ratones deficientes para PARP-1 (Parp-1-/-) y de ratones Parp-2-/- frente a los timocitos procedentes de ratones no modificados genéticamente pone de manifiesto que la actividad de poli-ADP-ribosilación mediada por PARP-2 no sería responsable de la mayor susceptibilidad a apoptosis detectada en los timocitos de los ratones Parp-2-/-, aunque el incremento significativo de la actividad PARP en ausencia de PARP-2 sí que podría, de alguna forma, afectar al fenotipo observado. Dicho incremento de actividad nos sugiere también un efecto de PARP-2 en una posible regulación negativa de la actividad enzimática de PARP-1. Por otra parte los estudios de estimulación de linfocitos T con PMA+ionomicina y anticuerpos anti-CD3 solos y en combinación con anticuerpos anti-CD28, nos han permitido demostrar la activación de PARP en linfocitos T tras la respuesta a estímulos que no producen daño aparente en el DNA. Sin duda alguna, la aplicación de la metodología optimizada en este trabajo puede ser de gran ayuda en el campo de la investigación de las reacciones de poli-ADP-ribosilación y a nivel clínico, si finalmente los ensayos clínicos con inhibidores de PARP en diferentes patologías resultan de utilidad clínica. Abstract: Several works report the importance of polyADPribose polymerase-1 in genic expression modulation during development and as an answer of specific cellular signals. PARP-1 is the founder member of a family, the PARP family, that synthesize ADP-ribose homopolymers to modify acceptor proteins related to chromatin stability and DNA metabolism. PARP-1 activity , representing 90% of poly-ADP-ribosilation in cells, could be able to modulate genic expression through ribosilation of other proteins, or by interaction with some other proteins as transcription factors. The aim of this work was the optimization of a quantitative method for measuring PARP activity in permeabilized cells, using NAD+-H-3 as substrate. During the optimization, the method showed good sensibility, accuracy and specificity. Once optimized, we run the method for measurement of PARP activity in inmune cells. The results of PARP activity in thymocytes of Parp-1-/- and Parp-2-/- mice show PARP-2 polyADPribosilation is not the cause of the increased sensibility to apoptosis detected in Parp-2-/- mice, even this increase of PARP activity in ausence of PARP-2 could in some way afect the phenotype observed. Stimulation studies of T lymphocytes with PMA+ionomicine and antibobies anti-CD3 and anti CD-28, demonstrated that PARP activation in T lymphocytes does not damage DNA. The method developed in this work could be very helpful in polyADPribosilation in the field of basic investigation and in a clinical level, if finally clinical trials with PARP inhibitors show clinical application