Ritmos de reproducción en el lenguado senegaléspapel del órgano pineal y la melatonina como transductores de los ciclos ambientales diarios, lunares y estacionales

Resumen

El objetivo general de esta tesis doctoral fue estudiar los ritmos de reproducción (diarios, lunares y estacionales) del lenguado senegalés, Solea senegalensis, e investigar el papel del órgano pineal y su hormona melatonina como transductores de los factores ambientales. Principalmente, se ha estudiado la influencia de la luz y la temperatura en los ritmos de melatonina, puestas y esteroides sexuales. Como objetivos específicos, esta tesis pretende contestar las siguientes preguntas: ' En condiciones ambientales constantes, ¿existe control endógeno sobre la producción de melatonina del órgano pineal en cultivo in vitro? ' ¿Cuál es el umbral de intensidad lumínica requerido para suprimir la producción nocturna de melatonina? ' ¿Cómo influye la longitud de onda de la luz sobre la inhibición de la síntesis de melatonina durante la noche? ' ¿En qué regiones del cerebro actúa principalmente la melatonina? ' ¿Existe un ritmo diario de sitios de unión de melatonina? ' Los ciclos lunares, ¿influyen sobre los ritmos de melatonina, de esteroides sexuales y de vitelogenina? ' ¿Es posible alterar los ritmos de reproducción manipulando el fotoperiodo? ' ¿Existen ritmos diarios de esteroides sexuales? ' La fluctuación natural de la temperatura del agua a lo largo del año, ¿posee algún papel sobre la sincronización de los ritmos anuales de esteroides sexuales y de puestas? ' El lenguado, ¿realiza su puesta a una determinada hora del día? ' Los ritmos de puesta, ¿están sincronizados con el ciclo lunar? Para responder a todas estas preguntas se realizaron diversos experimentos que aparecen en esta memoria organizados en 7 capítulos experimentales, los cuales se resumen a continuación. Capitulo experimental 1. RITMOS DIARIOS Y CIRCADIANOS DE PRODUCCIÓN DE MELATONINA IN VITRO POR EL ÓRGANO PINEAL DE DOS ESPECIES NOCTURNAS: EL LENGUADO SENEGALÉS (Solea senegalensis) Y LA TENCA (Tinca tinca) El objetivo de esta capitulo experimental fue estudiar los ritmos de melatonina producidos por el órgano pineal de dos especies nocturnas de teleósteos, el lenguado senegalés y la tenca, las cuales presentan una gran sensibilidad a la luz. Los órganos pineales se cultivaron in vitro en condiciones LD (12 h luz: 12 h oscuridad) para caracterizar el ritmo diario de producción de melatonina. Posteriormente, el cultivo in vitro se realizó en condiciones de oscuridad constante (DD) para dilucidar la existencia de control endógeno sobre el ritmo. En los órganos pineales cultivados bajo un ciclo LD, la síntesis rítmica de melatonina fue evidente en ambas especies, con valores bajos observados durante la fase de luz (15.6 ± 7.2 y 22.6 ± 2.6 pg/ml para el lenguado y la tenca, respectivamente) y valores altos coincidiendo con la fase de oscuridad (74.0 ± 8.2 y 82.1 ± 9.1 pg/ml para el lenguado y la tenca, respectivamente). En condiciones LD, los ritmos de melatonina tuvieron un período de 24h (p<0.001) y presentaron acrofases similares en ambas especies, entre 9-10 h después del apagado de las luces (2-3 h antes del final de la fase oscura). Cuando los órganos pineales se cultivaron en condiciones DD, los resultados fueron diferentes entre las dos especies estudiadas. En el caso de la tenca se observó la existencia de un ritmo circadiano significativo de liberación de melatonina por la pineal, con valores más bajos durante el día subjetivo (6.2 ± 1.6 pg/ml) que durante la noche subjetiva (20.4 ±5.5 pg/ml). El período del ritmo (tau) fue de 24.1 h (p<0.01) con la acrofase localizada aproximadamente 12 horas después del apagado de las luces (al principio del día subjetivo), ligeramente más tarde que la registrada bajo condiciones de LD. Sin embargo, los valores de melatonina en lenguado se mantuvieron altos durante todo el periodo de oscuridad (alrededor de 92.0 ± 6.9 pg/ml), incluyendo los períodos de día subjetivo. Resumiendo, estos resultados revelaron que el ritmo de liberación de melatonina en tenca se encuentra regulado endógenamente por un oscilador circadiano localizado en el órgano pineal, mientras que en el lenguado no hay evidencias de un control similar. Además, el ritmo de melatonina parece encarrilado exclusivamente por la luz. Capitulo experimental 2. RITMOS DE MELATONINA PLASMÁTICA EN EL LENGUADO SENEGALÉS EN CONDICIONES CONSTANTES DE LUZ Y OSCURIDAD. INFLUENCIA DE LA INTENSIDAD LUMÍNICA Y EL ESPECTRO. La luz es el sincronizador más importante de los ritmos de melatonina en peces. En este capítulo se estudia la influencia de las características de la luz sobre los ritmos de melatonina plasmática en el lenguado senegalés. Los resultados revelaron que la exposición a largo plazo a condiciones constante de iluminación u oscuridad (LL o DD), resultó en una producción total diaria de melatonina significativamente más elevada que en condiciones LD. Sin embargo, en condiciones de LL, la concentración de melatonina se mantuvo alrededor de 224 pg/ml a lo largo de las 24h, mientras que en condiciones de DD se produjo una elevación significativa (363.6 pg/ml) durante la tarde/noche. La aplicación de pulsos de luz de 1 hora de duración en MD (mitad de la fase de oscuridad), produjo una inhibición de la melatonina plasmática directamente proporcional a la intensidad de la luz (3.3, 5.3, 10.3 y 51.9 µW/cm2). El umbral de intensidad necesario para reducir la melatonina plasmática hasta valores similares a los observados en ML (mitad de la fase de luz) fue de 5.3 µW/cm2. La longitud de onda del pulso de luz también tuvo un efecto sobre la inhibición de la melatonina: mientras que la luz roja (?>600nm) no inhibía la melatonina plasmática significativamente, la luz violeta (?max=368nm) produjo una reducción de la concentración de esta indolamina, hasta valores semejantes a los de ML. Estos resultados sugieren que la presencia de una luz tenue (como la luz de la luna) durante la noche, podría ser percibida por el lenguado y encarrilar la expresión de sus ritmos de melatonina. Por otro lado, una luz roja tenue parece no inhibir la producción nocturna de melatonina, y como tal puede ser usada con seguridad durante los muestreos nocturnos. Capitulo experimental 3. SITIOS DE UNIÓN DE MELATONINA EN LENGUADO SENEGALÉS: DIFERENCIAS DÍA/NOCHE EN DENSIDAD Y LOCALIZACIÓN EN DIFERENTES REGIONES DEL CEREBRO En este capítulo se estudió la localización de los sitios de unión de melatonina en las distintas regiones del cerebro del lenguado (techo óptico, telencéfalo, cerebelo, hipotálamo, bulbos olfatorios y médula), y se investigaron las diferencias día/noche de densidad (Bmax) de estos sitios de unión, para lo que se tomaron muestras en ML y en MD. La concentración de melatonina plasmática se determinó mediante RIA (radioinmunoensayo), mientras que los análisis de sitios de unión se hicieron usando 2-[125I]iodomelatonina como radioligando. Las concentraciones de melatonina plasmática eran significativamente más bajas en ML (189.5 ± 46 pg/ml) que en MD (455.5 ± 163 pg/ml). Los valores de densidad eran significativamente más elevados en el techo óptico (5.6 ± 0.6 y 12.3 ± 1 fmol/mg prot, en ML y MD, respectivamente) y en el cerebelo (7.7 ± 1.1 y 10.6 ± 1.3 fmol/mg prot, en ML y MD, respectivamente), existiendo diferencias significativas día-noche en estas dos regiones. Estos resultados muestran por primera vez la distribución de los sitios de unión de melatonina en el cerebro de un pez plano así como la ausencia de regulación negativa en los mismos. Capitulo experimental 4. INFLUENCIA DEL CICLO LUNAR EN LA CONCENTRACIÓN PLASMÁTICA DE MELATONINA, VITELOGENINA Y ESTEROIDES SEXUALES EN LENGUADO SENEGALÉS, Solea senegalensis En un primer experimento, se estudió el efecto del ciclo lunar sobre los ritmos de melatonina plasmática del lenguado senegalés (Solea senegalensis) expuesto a condiciones de iluminación naturales (en el exterior) o artificiales (en el interior). Posteriormente, se examinó el efecto del ciclo lunar sobre las concentraciones de vitelogenina y esteroides sexuales (Testosterona, T; Estradiol, E2; 11-ketotestosterona, 11KT), usando para ello individuos maduros, durante la época de reproducción. En el primer experimento, en la noche de luna llena, las concentraciones plasmáticas de melatonina alcanzaron un pico en los tanques tapados (sin iluminación nocturna) de ambos grupos, tanto en los localizados en el exterior (133.2 ± 12.8 pg ml-1) como en el interior (190.6 ± 41.5 pg ml-1). Sin embargo, en los peces de los tanques descubiertos (tanto en exterior como en interior), que se encontraban expuestos a una intensidad aproximada de 0.3 lux, la melatonina plasmática nocturna se redujo significativamente (p<0.05), aproximándose a los valores de ML (79.6 ± 7.1 y 81.8 ± 14.0 pg ml-1, para el grupo exterior e interior, respectivamente). En la noche de luna nueva se observó un patrón similar en el grupo localizado en el exterior: los peces en el tanque cubierto presentaron una mayor concentración de melatonina que los del tanque descubierto, los cuales estaban expuestos a la casi indetectable iluminación natural nocturna. En el segundo experimento, se observaron concentraciones plasmáticas de esteroides sexuales significativamente más elevadas durante la luna llena que en la luna nueva. En el caso de las hembras, la concentración de E2 se redujo de 2.4 ± 0.6 a 0.4 ± 0.1 ng ml-1, mientras que la T descendió de 0.3 ± 0.0 a 0.2 ± 0.0 ng ml-1. Sin embargo, los valores de vitelogenina no presentaron tales diferencias entre las dos fases lunares. En los machos, la concentración de 11KT descendió de 14.3 ± 2.1 ng ml-1 (luna llena) a 4.7 ± 0.7 ng ml-1 (luna nueva), mientras que los valores de T fueron de 2.6 ± 0.4 y 1.0 ± 0.1 ng ml-1 durante la noche de luna llena y nueva, respectivamente. En conclusión, estos hallazgos señalaron la alta sensibilidad del lenguado senegalés a la luz de la luna, sugiriendo que la melatonina actúa como transductor del ciclo lunar en esta especie, y posee una función en la sincronización de sus ritmos de reproducción. Capitulo experimental 5. IMPACTO DE LA MANIPULACIÓN FOTOPERIÓDICA SOBRE LAS DIFERENCIAS DÍA/NOCHE DE LOS NIVELES PLASMÁTICOS DE MELATONINA, ESTEROIDES SEXUALES Y VITELOGENINA, Y EN LOS RITMOS DE PUESTA EN LENGUADO SENEGALÉS La reproducción en peces es un fenómeno estacional, que está sincronizado por las variaciones anuales del fotoperíodo y la temperatura. En este capítulo se investigó el papel del fotoperiodo en la sincronización de los ritmos de reproducción del lenguado senegalés. Para ello, los peces se mantuvieron bajo un fotoperiodo corto (9L:15D) desde el solsticio de invierno en adelante (grupo experimental), o bajo variaciones naturales de fotoperiodo (grupo control). Ambos grupos estaban expuestos a condiciones naturales de temperatura del agua. Se recogieron muestras de sangre durante la época de reproducción en los periodos de pre-puesta (marzo), puesta (abril) y post-puesta (mayo) para medir los valores plasmáticos de melatonina (MEL), esteroides sexuales (testosterona, T; 17?-estradiol, E2; y 11keto-testosterona, 11KT) y vitelogenina (VTG). La ocurrencia de puestas y la flotabilidad de los huevos también fueron monitorizadas. Los resultados revelaron un aumento significativo de concentración de MEL de marzo a mayo en el grupo control, mientras que en el grupo experimental no se produjo tal cambio estacional. Los valores plasmáticos de VTG, T E2 y 11KT fueron significativamente más elevados en el grupo experimental en marzo, aunque las diferencias dejaron de ser significativas en abril y mayo. Se observó un periodo de puesta similar en ambos grupos, aunque el grupo experimental empezó un poco antes (7 vs 18 de abril) y también acabó un poco antes (29 de abril vs 27 de mayo) que en el grupo control. Resumiendo, estos hallazgos demostraron que los ritmos de reproducción persistieron en la ausencia del aumento natural de horas de luz del invierno a la primavera. Sin embargo, la manipulación fotoperiódica alteró la modulación estacional de MEL, aumentó los niveles de esteroides sexuales y de VTG en el momento de la pre-puesta, y como resultado, se observó un ligero adelanto en la época de puesta. Capitulo experimental 6. DIFERENCIAS DÍA/NOCHE MENSUALES Y RITMOS DIARIOS ESTACIONALES DE ESTEROIDES SEXUALES EN LENGUADO SENEGALÉS (Solea senegalensis), BAJO CONDICIONES NATURALES DE TEMPERATURA O CONDICIONES AMBIENTALES CONTROLADAS En este articulo nos propusimos investigar la existencia de fluctuaciones diarias en la concentración plasmática de esteroides sexuales (17?-estradiol, E2 y testosterona, T) en hembras de lenguado senegalés (Solea senegalensis). Para ello, se describieron las concentraciones día/noche mensuales y los ritmos diarios estacionales en animales mantenidos en condiciones naturales de foto- y termociclo. Además, se investigó la influencia de la oscilación anual de la temperatura del agua en las concentraciones plasmáticas de estos esteroides, usando un grupo de lenguados mantenido bajo fotoperiodo natural pero expuesto a un termociclo atenuado (alrededor de 17-20 ºC) durante un año. A pesar de que no se detectaron diferencias día/noche en los muestreos mensuales, el análisis de Cosinor reveló la existencia de un ritmo anual de E2 y T (p<0.01) con la acrofase en febrero. Los valores máximos se observaron en marzo para ambos esteroides (6.1 ± 1.7 ng ml-1 en MD y 4.0 ± 0.6 ng ml-1 en ML para E2, y 1.4 ± 0.4 ng ml-1 en MD y 0.8 ± 0.1 ng ml-1 en ML para T), anticipando la época de puesta (mayo-junio). En cuando a los ritmos diarios estacionales, en el solsticio de primavera (21 marzo) se observó un ritmo diario de concentración plasmática en ambos esteroides (Cosinor, p<0.01) con las acrofases a las 20:00 h (E2) y a las 21:08 h (T). En verano, otoño e invierno no se observaron ritmos diarios debido a los bajos niveles de esteroides existentes en estas estaciones. Cuando las hembras de lenguado fueron sujetas a un ciclo atenuado de temperatura durante un año, los ritmos de esteroides desaparecieron (no se produjo un pico en primavera como en el grupo control), y no desovaron, a pesar de que se encontraban bajo un fotoperiodo natural. Estos resultados resaltan la importancia de la fluctuación anual de la temperatura del agua y del fotoperiodo en la sincronización de la puesta y el comienzo de la producción de esteroides en lenguado. Capitulo experimental 7. RITMOS LUNARES Y DIARIOS DE PUESTA EN EL LENGUADO SENEGALÉS (Solea senegalensis) En primavera, se observó una periodicidad de 29 días en los ritmos de puesta del lenguado senegalés (Solea senegalensis), con la acrofase localizada alrededor del cuarto menguante y de la luna nueva. Además, en ambas épocas de puestas, primavera y otoño, se observó un ritmo nocturno de puesta muy marcado, con el inicio de la puesta justo después del anochecer y la acrofase sobre las 23:00 h. Cuando se amplió artificialmente el fotoperiodo (de 10L:14D a 14L:10D), el lenguado se sincronizó al nuevo fotoperiodo: el desove ocurrió justo después del nuevo "anochecer", con el inicio gradualmente cambiando de las 21:00 h a las 23:00 h, y la acrofase de las 23:25 h a las 00:32 h. En condiciones de luz constante, el lenguado senegalés mantuvo el ritmo diario de puesta durante dos días, con una acrofase a las 22:49 h, lo que sugiere la existencia de un oscilador endógeno que podría controlar los ritmos de puesta. Estos hallazgos proporcionan nuevos conocimientos acerca de la fisiología de la reproducción de esta especie, que podrían ser de utilidad parala optimización de los protocolos de recolección de huevos y de producción de larvas de lenguado en acuicultura. Conclusiones Generales: 1. El órgano pineal del lenguado senegalés cultivado in vitro en condiciones LD, produce melatonina rítmicamente con periodicidad diaria, presentando valores más elevados durante la noche y similares a los descritos previamente in vivo. Sin embargo, en condiciones DD, este ritmo circadiano desaparece, indicando que el órgano pineal de esta especie carece de oscilador endógeno. 2. El lenguado senegalés es muy sensible a luz tenue, ya que un pulso de luz de una hora de duración con una intensidad de apenas 5.3 µW/cm2 inhibe la producción nocturna de melatonina, reduciendo los valores plasmáticos hasta valores similares a los registrados durante el día. Además, las diferentes longitudes de onda de luz no afectan igualmente la síntesis de melatonina: mientras que la luz roja no inhibe la melatonina, la luz blanca y violeta sí lo hacen. Por lo tanto, el uso de una luz roja tenue para el manejo de peces o muestreos durante la noche, es aparentemente seguro. 3. La melatonina parece actuar principalmente en el techo óptico y en el cerebelo, donde se ha observado mayor densidad de sitios de unión de esta hormona. En estas dos áreas del cerebro se registran diferencias día/noche de densidad de sitios de unión, con los valores más elevados durante la noche, lo que sugiere la ausencia de regulación negativa. 4. La producción nocturna de melatonina se inhibe por exposición a la luz de la luna llena, tanto natural como artificialmente simulada, y también por la casi indetectable iluminación de una noche de luna nueva. El ciclo lunar también afecta a la liberación de los esteroides sexuales, que presentan concentraciones significativamente más elevadas en noches de luna llena que de luna nueva, tanto en hembras (E2 y T) como en machos (11KT y T). Sin embargo, la vitelogenina mantiene su concentración constante en ambas fases lunares. 5. En hembras de lenguado senegalés se observa un ritmo anual de E2 y T, con los valores más altos registrados en marzo, y con la acrofase en febrero, coincidiendo con el periodo de pre-puesta. En ausencia de la oscilación natural de la temperatura del agua a lo largo del año, estos ritmos desaparecen, y los peces no desovan. Además, durante el solsticio de primavera se observa un ritmo diario de esteroides sexuales (E2 y T) en hembras, con la acrofase a las 20:00 y a las 21:08 h, respectivamente. 6. Cuando el lenguado senegalés se expone a un fotoperiodo corto desde el solsticio de invierno en adelante, no presenta el incremento nocturno de melatonina plasmática observado en primavera cuando los peces se mantienen con un fotoperiodo natural. La modulación estacional del ritmo de melatonina desaparece, pero los ritmos de vitelogenina, esteroides sexuales y puesta persisten. Sin embargo, las concentraciones de vitelogenina y esteroides son más elevadas en el periodo de pre-puesta, en comparación con los peces expuestos al fotoperiodo natural. Como resultado, se produce un ligero avance en el periodo de puesta. 7. En el lenguado senegalés se observan ritmos lunares de puesta, con la acrofase entre el cuarto menguante y la luna nueva. Además, el desove tiene lugar en las noches más oscuras. Este ritmo está probablemente relacionado con los ritmos lunares de esteroides, estando en anti-fase, con el ritmo de esteroides precediendo al de la puesta. 8. Las puestas de lenguado senegalés también presentan un ritmo diario en ambas épocas de reproducción (primavera y otoño). El desove se encuentra sincronizado con la puesta del sol, ocurriendo durante la primera mitad de la noche (en fase con los ritmos diarios de esteroides sexuales) y presentando una acrofase alrededor de las 23h. El ritmo diario de puesta es capaz de re-sincronizarse a un nuevo fotoperiodo, artificialmente ampliado 4 horas aunque en este caso se atrasa el momento del desove. Finalmente, en condiciones de luz constante, este ritmo de puestas persiste durante dos días.