Estudio de la funcionalidad espermática, interacción de gametos y análisis proteico en espermatozoides epididimarios y eyaculados en la especie porcina

Abstract

La capacitación es un proceso fisiológico que el espermatozoide debe experimentar para que la fecundación del ovocito tenga lugar. Este proceso se encuentra regulado en el espermatozoide por diferentes vías moleculares, varias de las cuales, a día de hoy, se desconocen o no están totalmente dilucidadas. Estos eventos moleculares que acontecen en el espermatozoide durante el proceso de capacitación están condicionados por distintos factores que rodean su entorno, entre los cuales podemos destacar el ambiente epididimario, el plasma seminal o las secreciones del aparato reproductor femenino como el fluido oviductal. El objetivo principal de este trabajo fue analizar el comportamiento de espermatozoides epididimarios-EP (en contacto con el fluido epididimario y no con el plasma seminal) y eyaculados-EY (en contacto con el plasma seminal) sometidos a 3 tratamientos diferentes: 1) Espermatozoides no tratados (grupo control-C); 2) Lavados a través de gradientes de Percoll e incubados en medio de capacitación TALP (grupo lavados-L); 3) Espermatozoides lavados e incubados en Fluido Oviductal Porcino (grupo FOP). Los espermatozoides de los diferentes grupos experimentales fueron analizados mediante diversas técnicas según los experimentos realizados: " Experiencia I - Análisis espermático: se analizaron los parámetros de motilidad, descondensación de la cromatina y reacción acrosómica. " Experiencia II - análisis de la interacción de gametos y fecundación: se evaluó la unión espermática a la zona pelúcida y la activación y formación pronuclear mediante la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). " Experiencia III - análisis de la fosforilación de la tirosina: evaluado mediante Western-blot (WB) e inmunofluorescencia indirecta (IFI). I. Al realizar el análisis de los parámetros de motilidad en los 6 grupos experimentales, (EP y EY x C, L y L-FOP) observamos que en los espermatozoides de EP el grupo C se comportaba de diferente manera en prácticamente todos los parámetros respecto al grupo L, sin embargo el grupo FOP en algunos casos era similar al grupo C y en otros a ambos grupos (C y L). Si comparamos los 3 grupos experimentales de espermatozoides EY entre sí, el grupo C en la mayoría de los parámetros estudiados se comportaban de manera diferente a los grupos L y L-FOP, siendo estos similares en la mayoría de los parámetros analizados. Por otro lado, observamos una menor descondensación de la cromatina en los grupos C, en relación a los grupos L y L-FOP. Además, se evaluó la reacción acrosómica a diferentes tiempos de incubación de los espermatozoides con medio de capacitación (EP: C, 0h, 3h y FOP-3h; EY: C, 0h, 3h y FOP-3h). Los valores más elevados de espermatozoides reaccionados correspondieron al grupo FOP-3h. En términos generales y para los parámetros estudiados, observamos que los grupos L y L-FOP independientemente del origen espermático se comportan de una manera similar entre sí y diferentes de los grupos C. II. En el grupo de espermatozoides incubados con FOP se observó, en ambos tipos de espermatozoides (EP y EY), un descenso de estos a la unión a la zona pelúcida comparado con los otros 2 grupos experimentales, donde en el grupo C se obtuvieron los valores más elevados de unión. En el caso de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides, la activación ovocitaria y la descondensación espermática fueron menores en el grupo EP que en el EY. Observamos una mayor activación y descondensación espermática en los grupos L y L-FOP correspondiente al grupo EY. Teniendo en cuenta todos los datos de este apartado, podemos decir que el FOP modula la unión espermática a la ZP y a su vez, junto con el grupo L, provoca una mayor activación ovocitaria y grado de descondensación espermática. III. En esta última experiencia se analizó la fosforilación de residuos de tirosina. En primer lugar se analizó la fosforilación mediante WB. En términos generales, encontramos bandas reactivas a la fosforilación de tirosina entre 15 y 175 kDa. Una de las diferencias significativas entre espermatozoides EP y EY, fue la ausencia de la banda de 20 kDa en el grupo C de EY, con respecto al resto de grupos experimentales. Además, y según la bibliografía unas de las proteínas más importantes a la hora de valorar la capacitación en la especie porcina es la fosforilación de la banda de 32 kDa (p32). En espermatozoides de EP, ésta aparece fosforilada con poca intensidad en los grupos C y L. En el grupo EY, aparece claramente en el grupo L pero no en el grupo C. Teniendo en cuenta por separado los experimentos realizados en este apartado: " Efecto de la presencia albúmina (BSA): el patrón de bandas fosforiladas fue similar, independientemente del uso de BSA. " Efecto de la incubación con FOP: en espermatozoides EP el grupo C y L presentaban menos fosforilación de la p32 que en el grupo FOP. En el grupo EY no se encontraron diferencias sobre el patrón de bandas con respecto al grupo L cuando se incubaron los espermatozoides en FOP. " Efecto del tiempo de incubación: el tiempo de incubación influye en mayor medida en los espermatozoides de EP, donde a las 4 horas de incubación, las bandas de 44, 42 y 32 kDa aumentan en intensidad con respecto a los otros grupos experimentales de EP, adquiriendo un patrón similar a los espermatozoides EY. Por último, se analizó la localización de la fosforilación de tirosina mediante IFI en los espermatozoides sometidos a los mismos tiempos de incubación que el experimento anterior. Se obtuvieron 8 patrones diferentes de fosforilación los cuales fueron reagrupados en 3: I. Espermatozoides no capacitados: espermatozoides sin ninguna fluorescencia, fluorescencia baja o en región acrosomal y/o cola. II. Espermatozoides capacitados fosforilados en las regiones subecuatorial y acrosomal. III. Espermatozoides capacitados fosforilados en la región subecuatorial, acrosoma y/o cola. Los grupos C presentaron el porcentaje más alto de espermatozoides con una baja fosforilación o ausencia de la misma (no capacitados). En el caso de los espermatozoides considerados como capacitados encontramos que para el grupo de espermatozoides del grupo III, el mayor porcentaje de espermatozoides inmunorreactivos a fosfotirosina se encontraron en los espermatozoides de EP (EP-L 0, 3 y 4h), seguido de EY-L 0h, mientras que los grupos FOP (tanto en EP como EY) el porcentaje de fosforilación fue menor. Esto nos podría indicar el papel modulador del FOP en el proceso de capacitación. Por otro lado, la fosforilación en el flagelo se asocia con la hiperactivación. Nuestros resultados mostraron que en los grupos C y EY-0h la fosforilación de la cola fue baja o nula con respecto al resto de grupos.