Mecanismos regulatorios de las actividades oxidasa en marinomonas mediterráneas

Resumen

La bacteria marina Marinomonas mediterranea fue aislada de las costas murcianas del mar Mediterráneo y forma parte de la microbiota asociada a la planta marina Posidonia oceanica. El interés de este microorganismo marino está basado en sus características fisiológicas únicas. Es una bacteria Gram-negativa y melanogénica que expresa diferentes actividades oxidasa de interés biotecnológico. Así, posee todas las polifenol oxidasa (PPO) conocidas, ya que expresa dos cuproproteínas diferentes. La primera, conocida como PpoA, es una multicobre oxidasa (MCO) con actividad lacasa y tirosinasa, cuya función fisiológica aún es desconocida. La segunda PPO, PpoB1, es una tirosinasa activable por SDS que está implicada en la síntesis de melaninas. M. mediterranea también sintetiza otra oxidasa, denominada LodA, con actividad L-lisina-?-oxidasa (LOD) (EC 1.4.3.20). Esta enzima genera peróxido de hidrógeno como producto de la oxidación de la L-lisina, lo que le confiere actividad antimicrobiana. Se ha demostrado que LodA contribuye al desarrollo de biopelículas microbianas provocando muerte celular en el centro de las microcolonias. La gran variedad de actividades oxidasa expresadas por esta bacteria la convierten en un buen modelo para el estudio de la relevancia fisiológica de estas enzimas y de los mecanismos regulatorios de su expresión. Una primera aproximación seguida en esta tesis para el estudio de la relevancia fisiológica de las actividades oxidasa de M. mediterranea, fue la construcción de mutantes con deleciones en los genes lodAB, ppoA y ppoB, así como un doble mutante ppoA/ppoB. Estos mutantes fueron obtenidos con el marcador sacB, que hasta ahora ha sido muy poco utilizado en bacterias marinas. La deleción de un gen produjo la pérdida de actividad enzimática de la proteína codificada por dicho gen, sin afectar a los niveles de las otras oxidasas, lo que indica que la expresión de cada oxidasa es independiente del resto. La deleción de las oxidasas no afecta al crecimiento ni a la supervivencia de M. mediterranea en medios de cultivo con limitación por fuente de carbono o de nitrógeno. En esta última condición de cultivo, M. mediterranea muestra una alta tasa de supervivencia incluso cuando sintetiza melaninas en presencia de L-tirosina. De igual manera, la deleción de dichos genes no afecta a la supervivencia celular en presencia de compuestos fenólicos u oxidantes. En cuanto a los mecanismos regulatorios, la actividad LOD es inducida por L-lisina, L-arginina, L-ornitina, L-norleucina y DAP, de los cuales sólo la L-lisina es sustrato de la enzima. Los estudios regulatorios utilizando tanto fusiones PlodAB-lacZ, como la técnica de la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), revelaron que estos compuestos inductores actúan a nivel post-transcripcional. Por otro lado, la actividad LOD es reprimida a nivel transcripcional por el aminoácido L-tirosina. Estos efectos regulatorios de aminoácidos no afectan a las actividades PPO, siendo por tanto específicas de LOD. La actividad LOD de M. mediterranea parece tener otros elementos regulatorios comunes con las actividades PPO. Por un lado, todas son inducidas durante la fase estacionaria de crecimiento y por otro, los niveles de actividad enzimática de las mismas son mucho menores en el mutante T103. Este mutante está afectado en la histidín quinasa sensora de membrana PpoS. Sin embargo, existen diferencias en el tipo de regulación que sobre las tres oxidasas objeto de estudio, ya que PpoS regula la actividad LOD a nivel transcripcional, mientras que PpoB está regulada a nivel post-transcripcional. La regulación de PpoA parece ser tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional. Estas observaciones sugieren que pueden estar interviniendo elementos adicionales en dicha regulación. Además de T103, nuestro grupo había detectado otro mutante regulatorio afectado en las actividades PPO, llamado T102. En este trabajo se logró, mediante el uso de la técnica del paseo cromosómico, la clonación y secuenciación del gen interrumpido por el transposón mini-Tn10 en el mutante T102. Este gen muestra similitud con los reguladores de respuesta en los sistemas de dos componentes y se le denominó ppoR, por regulador de las actividades PPO. Mediante RT-PCR se ha demostrado que ppoR forma parte de un operón junto con uvrC. Los mutantes T103 (PpoS-) y T102 (PpoR-) muestran gran similitud fenotípica. Ambos son amelanogénicos, tienen bajos niveles de actividad PPO y en ninguno de los dos se detecta actividad LOD. Tanto T103 como T102 están afectados en el crecimiento en medios limitados por nitrógeno y en la supervivencia celular en medios limitados por carbono. Todos estos datos constituyen evidencias genéticas de que ambas proteínas interaccionan en un mismo sistema de fosfotransferencia, que es una versión compleja de los sistemas regulatorios de dos componentes Sistemas similares a PpoS/PpoR se han descrito en otras gammaproteobacterias, donde controlan diversos procesos celulares y reciben diferentes denominaciones, por ejemplo GacS/GacA en Pseudomonas. El sistema detectado en M. mediterranea es el primero descrito que controla la expresión de una proteína antimicrobiana al mismo tiempo que la expresión de PPO, y con ello la síntesis de melaninas. Además, también participa en el control de la muerte celular en medios limitados por carbono y en el crecimiento en medios limitados por nitrógeno.