Nuevos mecanismos implicados en la deficiencia de antitrombinarelevancia de la N-glicosilación= new mechanisms involved in antithrombin deficiency: relevance of N-glycosylation

Resumen

Introducción La antitrombina es el principal anticoagulante endógeno. Sus principales dianas son el factor Xa (FXa) y la trombina (FIIa). Dicha serpina se sintetiza en el hígado y presenta cuatro sitios de N-glicosilación (N96, N135, N155, N192) . Este proceso ocurre sobre las asparraginas que se encuentran en contexto de esta secuencia consenso, Asn-X-Ser/Thr/Cys. La N135 no es eficientemente glicosilada, sólo en el 50% de las ocasiones y por lo tanto en plasma hay dos glicoformas: ?-antitrombina y ?-antitrombina, con cuatro y tres glicanos, respectivamente. La pérdida del glicano en posción 135 produce que la ?-antitrombina tenga mayor afinidad por heparina y como consecuencia un mayor aclaramiento. Por esta razón en plasma sólose detecta un 10% de esta glicoforma. La función de este anticoagulante puede estar potenciada por la unión de glicosaminoglicanos al sitio de unión a heparina. Además, su mecanismo inhibitorio también depende la secuencia del centro reactivo, mediante el cual la proteína interacciona con la proteasa diana. Así, la antitrombina es muy sensible incluso a pequeñas modificaciones, como mutaciones puntales. El papel clave de la antitrombina queda reflejado en el alto riesgo de trombosis asociado a su deficiencia (OR: 10-20). Las consecuencias de estas mutaciones definen dos tipos de deficiencia: tipo I (no se detecta forma mutada en el plasma), o tipo II (la forma mutada secretada tiene afectada la actividad inhibitoria). Dentro de las deficiencias tipo II hay tres subgrupos: i) tipo IIa, afectan a la reactividad , ii) tipo IIb, disminuyen la afinidad por heparina, iii) tipo IIc o pleiotrópicas, localizadas en la lámina C y con múltiples efectos. Objetivos 1. Caracterización de nuevos factores de riesgo trombótico asociados con la deficiencia de antitrombina. 2. Identificación de nuevas regiones implicadas en la funcionalidad de la antitrombina. 3. Evaluación del proceso y papel de la N-glicosilación de antitrombina. Métodos Para llevar a cabo estos objetivos estudiamos mutaciones naturales en sujetos con deficiencia de antitrombina. Posteriormente, empleamos un sistema recombinante para producir estos mutantes y otros, con mutaciones no descritas previamente y los purificamos por cromatografía de afinidad por heparina e intercambio aniónico. A continuación, realizamos su caracterización profunda mediante estudios bioquímicos: afinidad por heparina, cinéticas de inhibición, temperatura de desnaturalización, glicómica, proteómica, SDS-PAGE y geles en condiciones no desnaturalizantes. Los resultados obtenidos a partir de estos ensayos generaron las siguientes conclusiones: Conclusiones 1. La heterocigosis compuesta que implica a la mutación A384S, es relativamente frecuente en pacientes con deficiencia de antitrombina (2/96, 2%). Este estado afecta significativamente la capacidad anticoagulante e incrementa tanto el riesgo trombótico como la severidad clínica. Estos datos junto a la ineficacia de los test trombofílicos empleados, para detectar la mutación A384S, animan a evaluar esta alteración mediante métodos moleculares en estudios familiares de pacientes con deficiencia de antitrombina, incluso si el probando no presenta esta alteración genética. 2. Identificamos una nueva región en antitrombina (la puerta de salida del loop reactivo internalizado en la lámina A central) relevante en el mecanismo inhibitorio de esta serpina, concretamente afecta a la inserción del loop reactivo durante la traslocación de la proteasa al polo opuesto de la antitrombina para su completa inhibición. 3. La lámina C es una región relevante en la correcta maduración de los N-glicanos de antitrombina. Mutaciones en esta región provocan la aparición de una variante con glicosilación aberrante que provoca la reducción de la afinidad por heparina. 4. La introducción de una secuencia aromática (Phe-X-Asn-Y-Thr) en posición 135 de la antitrombina consigue una glicosilación completamente eficaz, dificultando la activación inducida por la unión de heparina. Estos resultados apoyan que las secuencias aromáticas podrían ser empleadas para favorecer una glicosilación más eficiente en diferentes contextos estructurales. 5. Las mutaciones que generan nuevas secuencias de glicosilación en el RCL son correctamente glicosiladas y plegadas, pero el nuevo glicano interfiere con la reactividad de la serpina por diferentes mecanismos dependiendo de la localización de glicano. El mutante G392N presenta especificidad de proteasa diana, ya que puede inhibir al FXa, pero no al FIIa, lo que podría tener implicaciones terapéuticas. Introducction Antithrombin plays a key role in the haemostatic system as it is the most important inhibitor of proteases, such as thrombin (FIIa) and factor Xa (FXa). This serpin presents four N-glycosylation sites (N96, N135, N155, N192). N-glycosylation of proteins takes place on the asparagines located in the context of a tripeptide consensus sequence (Asn-X-Ser/Thr/Cys). However, N135 is not efficiently glycosylated and only 50% of the molecules are glycosylated at this position. Therefore, there are two glycoforms in plasma: ?-antithrombin and ?-antithrombin, with four and three N-glycans, respectively. The lack of carbohydrate in N135 causes an increased heparin affinity and faster clearance of ?-antithrombin (10% detected in plasma) in comparison with the ?-glycoform. The anticoagulant function of antithrombin is accelerated by the binding of glycosaminoglycans on the heparin binding site. Moreover, the inhibitory mechanism is also dependent on the sequence of the reactive center loop because it interacts with the target proteases. This mechanism is very sensitive and even point mutations may provoke different anithrombin deficiencies. Antithrombin deficiency is a high thrombotic risk (OR: 10-20) and is classified in different types: type I (the mutant antithrombin is not detected in plasma) and type II (the mutant protein is secreted and it has affected the inhibitory activity). Type II antithrombin deficiencies are further subclassified in three groups: i) type IIa, mutations affecting the reactivity, ii) type IIb, mutations decreasing the heparin affinity and iii) type IIc or pleiotropic, mutations located in the C-sheet with multiple effects. Aims 1. Characterization of new thrombotic risk factors associated with antithrombin deficiency. 2. Identification of new regions relevant for the antithrombin function. 3. Evaluation of the role and process of glycosylation in antithrombin. Methods To perform these aims we studied natural mutations in subject with antithrombin deficiency. Then, we produced these mutants and other mutations not describe previously by a recombinant system. We purified different variants by heparin affinity and anion exchange chromatography in order to perform their biochemical characterization. The assays carried out were: heparin affinity by measuring the intrinsic fluorescence during heparin titration and stopped flow, kinetic studies with FIIa and FXa, determination of the melting temperature, glycomic, proteomic, non denaturing and SDS-PAGE. The results obtained after these studies rendered these conclusions: Conclusions 1. Compound heterozygosity involving the A384S mutation is relatively frequent among patients with antithrombin deficiency. This state significantly impairs the anticoagulant capacity and increases the risk of venous thrombosis and the severity of clinical manifestations. Moreover, the failure of usual thrombophilic tests to detect A384S mutation, encourage the evaluation of potential compound heterozygosis involving A384S in familial studies, even if the proband does not carry this mutation. 2. The opening for the internalized RCL to exit from the central A-sheet is a key new region for the reactive center loop insertion. Mutations in this region affect to the dragged of the covalently bound protease to the opposite end of antithrombin for the complete inhibition. 3. The C-sheet is a relevant region for the correct maturation of N-glycans on antithrombin. The aberrant glycosylation induced by mutations on residues of the C-sheet reduces the heparin affinity. 4. The introduction of the aromatic sequon (Phe-X-Asn-Y-Thr) on N135 of antithrombin improves the efficiency of N-glycosylation hindering the changes induced by heparin. These results support that this aromatic sequon may be used for an efficient glycosylation in structural contexts other than reverse turns. 5. Mutations introducing new glycans on the reactive center loop of antithrombin are correctly glycosylated and the variants are secreted, but interfere in the reactivity. The N392 variant determines specificity of protease, since this variant properly inhibits FXa but not FIIa.