Estudio del efecto de la degeneración de los fotorreceptores en la población de células ganglionares de la retina

Resumen

Estudios previos de nuestro laboratorio documentaron por primera vez que la degeneración de los fotorreceptores en ratas pigmentadas conduce a la compresión de los axones de las células ganglionares de la retina provocando la posterior muerte de estas. Las causas por las que la pérdida de los fotorreceptores afecta a la población de células ganglionares de la retina no son bien conocidas, ya que no está claro si dependen de factores como la pigmentación ocular o la etiología de la degeneración. Para intentar dilucidar estas cuestiones, en este trabajo hemos analizado el curso temporal de degeneración de los fotorreceptores, y la consecuente afectación de retina interna en dos modelos de degeneración retiniana: uno inducido por fototoxicidad y otro causado por una mutación genética hereditaria. Posteriormente, realizamos un análisis detallado, tanto cuantitativo como topográfico, de la afectación de las células ganglionares de la retina tras la pérdida de estos fotorreceptores inducida por ambas etiologías. Objetivos Desarrollar un modelo de degeneración de los fotorreceptores por fototoxicidad en rata albina. Caracterizar los efectos de la fototoxicidad a largo plazo en la retina, en concreto en la población de células ganglionares de la retina y en sus axones tras la pérdida de fotorreceptores. Estudiar si la dilatación pupilar influye en la degeneración. Analizar la evolución de la degeneración de la retina de la rata P23H-1, una rata albina que sufre una degeneración hereditaria de los fotorreceptores. Caracterizar los efectos de la pérdida de fotorreceptores, a largo plazo, en la población de células ganglionares de la retina y en sus axones. Realizar una comparación de estos dos modelos animales de degeneración retiniana. Comprobar si la degeneración cursa de forma similar o diferente dependiendo de su etiología. Material y métodos En este trabajo se han utilizado ratas hembra albina adultas de 2 estirpes diferentes: Sprague-Dawley y P23H-1 homocigóticas. Se realizaron distintos grupos experimentales organizados según las manipulaciones experimentales. Para desarrollar el modelo experimental de degeneración de los fotorreceptores por fototoxicidad, se fotoexpusieron ratas albinas Sprague-Dawley a una fuente de luz blanca fría fluorescente durante 48 horas. Antes de la fotoexposición se instiló a los animales una gota de atropina en el ojo izquierdo para provocar una midriasis máxima, que se mantendría durante todo el periodo de fotoexposición. La fotoexposición siempre comenzó en el mismo intervalo horario, ya que el ritmo circadiano puede afectar a la severidad de la degeneración por fototoxicidad. Se utilizaron dos fuentes de luz distintas: un "túnel de luz" (en el que los tubos de luz rodean las cajas de los animales) y unos tubos de luz en el techo (por encima de las cajas de los animales). Se realizaron varios grupos experimentales organizados según el objetivo y la duración del periodo de estudio tras la exposición a la luz (en el caso de animales fotoexpuestos) o tras el nacimiento (en el caso de los animales con degeneración hereditaria de los fotorreceptores). Estos tiempos fueron: inmediatamente, 7 días, 1, 3, 6, 9 y 12 meses tras la fotoexposición en las ratas SD y 1, 3, 6, 9 y 12 meses tras el nacimiento en las ratas P23H-1. Para estudiar el curso temporal de degeneración de los fotorreceptores se realizaron cortes sagitales del ojo de un espesor de 3 µm en un microtomo. Estos cortes fueron posteriormente teñidos con hematoxilina-eosina o procesados para la detección de núcleos apoptóticos mediante la técnica de TUNEL. Otros ojos fueron procesados para realizar montajes globales de las retinas, y en ellos se realizaron las siguientes técnicas: Para estudiar la vascularización de la retina tras la fototoxicidad algunos animales recibieron una inyección en la vena femoral de una solución de peroxidasa de rábano (HRP) diluida en suero salino 15 minutos antes de ser sacrificados. Para estudiar el efecto de la pérdida de fotorreceptores en la población de células ganglionares de la retina, una semana antes del procesado del animal se aplicó en la superficie de ambos colículos superiores el trazador neuronal fluorescente Fluorogold para trazar, por transporte axonal retrógrado, las células ganglionares de la retina. Tras la disección de la retina se realizó la inmunodetección del Brn3a, que es un factor de transcripción específico de las células ganglionares de la retina. Para estudiar el efecto de la pérdida de los fotorreceptores en los axones intrarretinianos de las células ganglionares de la retina que forman la capa de fibras nerviosas, se inmunodetectó la subunidad pesada fosforilada de los neurofilamentos en las retinas que habían sido previamente trazadas con FG e inmunodetectadas con Brn3a. Además, de algunos ojos se realizaron secciones sagitales de 15 ?m de grosor en el criostato y fueron procesadas para la inmunodetección de la subunidad pesada del neurofilamento y de las células endoteliales de los vasos retinianos. Todas las muestras fueron examinadas y fotografiadas en un microscopio de fluorescencia equipado con una platina motorizada controlada por un sistema de análisis de imagen: Image-Pro Plus¿ (IPP 5.1 para Windows¿; Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA). Para hacer reconstrucciones de las retinas completas se capturaron imágenes individuales de forma secuencial y no solapada comprendiendo toda la superficie de la retina y posteriormente fueron unidas para formar el fotomontaje de la retina completa. Las imágenes digitales individuales, tanto de Fluorogold como de Brn3a, fueron procesadas por una serie de rutinas específicas para cada marcador, desarrolladas con el programa de análisis de imagen IPP para realizar el contaje automático. Los datos cuantitativos obtenidos de cada retina, se usaron para generar los correspondientes mapas de isodensidad de las CGR. Resultados El marcaje de los vasos sanguíneos con peroxidasa de rábano (HRP) en los montajes globales de las retinas, nos permitió documentar que en el cuadrante superotemporal de las mismas se producía una extravasación difusa de esta sustancia en algunos de los animales fotoexpuestos. Esta extravasación fue observada inmediatamente tras la fotoexposición y se mantenía hasta los 7 días tras la fotoexposición. El grosor medio de la capa nuclear externa en las secciones teñidas con hematoxilina-eosina fue de 10-12 núcleos en los animales controles. Tanto en las ratas Sprague-Dawley fotoexpuestas como en las ratas P23H-1 se observó una degeneración progresiva de los fotorreceptores que era, al principio, más severa en la zona dorsal de la retina en los animales fotoexpuestos y en la zona ventral de la retina en las ratas P23H-1. El efecto de la fotoexposición al túnel de luz fue más severo, al menos durante los primeros meses tras la fotoexposición, que la fotoexposición a los tubos de luz en el techo. Sin embargo, a los 3 meses tras la fotoexposición no hubo diferencias entre la degeneración inducida por ambas fuentes de luz. La desorganización retiniana continuó avanzando con el tiempo tras la fotoexposición o tras el nacimiento y a los 6 meses la capa nuclear externa había desaparecido en los dos modelos experimentales. Es en este momento cuando comienza a observarse la aparición de complejos vasculares subretinianos situados entre el epitelio pigmentario de la retina y la membrana de Bruch. Estos vasos subretinianos están conectados con vasos verticales que están rodeados de células del epitelio pigmentario de la retina, que migran a lo largo de su superficie. Estos vasos verticales son vasos de retina interna que han sido arrastrados hacia los vasos subretinianos, su frecuencia de aparición aumenta con la duración del periodo de estudio y, en su trayecto, arrastran los axones de las células ganglionares de la retina, comprimiéndolos y provocando la muerte de las mismas. La técnica de TUNEL nos permitió documentar que la muerte de fotorreceptores tras fototoxicidad ocurre, al menos en parte, por la vía de la apoptosis. Además, pudimos observar como los núcleos TUNEL positivos (en apoptosis) se observaban con mayor frecuencia inmediatamente tras la fotoexposición en la retina dorsal, en la zona que coincidiría con la extravasación de peroxidasa observada previamente en los montajes globales. La cantidad de núcleos TUNEL positivos disminuía al aumentar el tiempo tras la fotoexposición, no observándose ningún núcleo en apoptosis 1 mes tras la fotoexposición. En la capa de fibras nerviosas de los animales control se observó una disposición de los axones muy similar a la que había sido previamente descrita (trayectoria centrípeta y rectilínea y marcaje más intenso en las porciones más centrales de la retina). Este patrón se mantuvo en los animales fotoexpuestos hasta los 3 meses tras la fotoexposición y en las ratas P23H-1 hasta los 6 meses tras el nacimiento. A partir de entonces, podía observarse, a gran aumento, como las trayectorias de los axones estaban distorsionadas mostrando áreas de estrangulamiento axonal. Estos estrangulamientos eran el resultado de las compresiones axonales causadas por el desplazamiento de vasos de retina interna y eran más frecuentes, al principio, en la retina dorsal en los animales fotoexpuestos y en la retina ventral en las ratas P23H-1. No obstante, con el tiempo estas compresiones axonales aparecían cada vez con mayor frecuencia y severidad, extendiéndose por toda la retina en los dos modelos experimentales. El número medio de células ganglionares de la retina trazadas con Fluorogold desde el colículo superior en las retinas de los animales Sprague-Dawley control fue de 81.381±3.722 (Media±DEM) a los 2 meses de edad, de 83.641±2.751 a los 12 meses de edad y de 81.871±4.040 a los 20 meses de edad. La inmunodetección con Brn3a en estas mismas retinas reveló un número medio de células ganglionares de la retina marcadas de 85.997±3.562 a los 2 meses de edad, de 85.861±3.982 a los 12 meses de edad y de 82.810±3.544 a los 20 meses de edad. Estos datos confirman que el número medio de células ganglionares de la retina no sufre variaciones con la edad en estos animales, al menos durante los 20 primeros meses de edad. En los mapas de isodensidad se observó que la mayor densidad de CGR en las retinas de los animales controles se encuentra en una región horizontal 1 mm por encima del disco óptico. En las ratas Sprague-Dawley fotoexpuestas, se observó una disminución en el número medio de células ganglionares de la retina que fue significativa a los 6 meses tras la fotoexposición. El número medio de células ganglionares de la retina disminuía conforme aumentaba el tiempo de supervivencia del animal tras la fotoexposición con independencia del marcador utilizado, siendo el número medio de éstas de 70.806±2.422 (n=8) y 67.228±5.121 (n=10) a los 9 y 12 meses tras la fotoexposición, respectivamente, cuando eran trazadas con Fluorogold y de 72.260±1.816 (n=8) y 68.651±3.825 (n=10) a los 9 y 12 meses tras la fotoexposición, respectivamente, cuando eran inmunodetectadas con Brn3a. En las ratas P23H-1 se observó una disminución en el número medio de células ganglionares de la retina que fue significativa a los 12 meses de edad. El número medio de células ganglionares de la retina trazadas con Fluorogold fue de 75.786±1.894 (n=10), 75.184±1.913 (n=10), 76.667±3.576 (n=12), 73.960±4.687 (n=10) y 69.921±3.150 (n=10) en los animales procesados 1, 3, 6, 9 y 12 meses tras el nacimiento, respectivamente, siendo el número medio de células ganglionares de la retina inmunodetectadas con Brn3a en estas mismas retinas de 81.599±2.903 (n=10), 81.338±2.845 (n=10), 81.372±4.345 (n=12), 77.921±3.476 (n=10) y 74.503±2.795 (n=10) en los animales procesados 1, 3, 6, 9 y 12 meses tras el nacimiento, respectivamente. Cuando comparamos los resultados obtenidos con ambas estirpes, observamos que el número de células ganglionares de la retina en la rata P23H-1 es inferior al de la rata Sprague-Dawley, siendo esta diferencia estadísticamente significativa ya en el primer tiempo estudiado: 1 mes de edad. Conclusiones La exposición de ratas hembra adultas Sprague-Dawley a luz blanca fría fluorescente provoca muerte de fotorreceptores que es mayor, en principio, en la región dorsal de la retina aunque posteriormente se extiende al resto de la retina. Esta muerte ocurre principalmente por la vía de la apoptosis. La fuente de luz utilizada influye en la muerte de fotorreceptores, siendo más severa cuando los animales se exponen al "túnel" de luz que rodea las cajas que cuando se exponen a los tubos de luz en el techo. La dilatación pupilar también influye en la muerte de fotorreceptores, al menos al principio, ya que ésta es más grave en los ojos en los que se dilata la pupila, al menos en los 3 primeros meses tras la fotoexposición. La muerte de fotorreceptores en la rata P23H-1 muestra en su inicio una regionalidad, siendo más severa en la retina ventral. La población de células ganglionares de la retina en las ratas P23H-1 homocigóticas es inferior a la observada en las ratas Sprague-Dawley, incluso al mes de edad de estos animales transgénicos. En ambos modelos, se observa una regionalidad en la degeneración de los fotorreceptores que depende de la etiología de la degeneración: en la degeneración inducida por fototoxicidad comienza en la retina dorsal y en la degeneración hereditaria comienza en la retina ventral. Se observa también una regionalidad de las alteraciones vasculares y axonales, que depende de la etiología de la degeneración ya que comienza en la retina dorsal en la degeneración inducida por fototoxicidad y en la retina ventral en la degeneración hereditaria de los fotorreceptores. No obstante, los eventos que se producen en su desarrollo son similares en los dos modelos experimentales, lo que indica que son secundarios a la degeneración de fotorreceptores. Estos eventos dan lugar a una disminución en el número medio de células ganglionares de la retina, que ha sido observada tanto si las células ganglionares de la retina se identifican por marcaje axonal retrógrado con Fluorogold, como por inmunodetección del Brn3a, por lo que se puede descartar que sea debido a un déficit en el transporte axonal.