Desarrollo de un protocolo de transformación genética de albaricoquero independiente del genotipo

Laburpena

El albaricoquero (Prunus armeniaca L.) es una de las especies más relevantes, a nivel económico, dentro de los frutales de hueso, en los países de la Cuenca Mediterránea. Los programas de mejora genética de esta especie se han centrado en varios aspectos fundamentales: calidad, época de maduración, autocompatibilidad y resistencia a virus. El desarrollo de protocolos de transformación genética podría permitir obtener variedades mejoradas de forma discreta en un plazo relativamente corto. La mayoría de los protocolos de transformación desarrollados en especies de Prunus han utilizado explantos juveniles procedentes de semillas. Entre ellos cabe destacar un protocolo desarrollado para ciruelo europeo que transforma hipocotilos con elevada eficiencia. Sería muy interesante disponer en albaricoquero de un protocolo eficiente de transformación similar utilizando como explantos semillas maduras, ya que sería muy útil para abordar diferentes objetivos como pruebas de concepto (comprobación de construcciones, desarrollar protocolos para eliminar marcadores, etc.) o estudios de genómica funcional evaluando la actividad de determinados genes en esta especie. Asimismo, resultaría de gran interés para la obtención de patrones de albaricoquero transgénicos ya que la mayoría de las variedades de albaricoquero se injertan sobre patrones francos (semillas germinadas de albaricoquero) porque no existen patrones comerciales de esta especie. Otra ventaja que tiene utilizar semillas maduras es que podemos disponer de este material durante todo el año si se conserva en frío. En este trabajo se ha estudiado la posibilidad de desarrollar un método de regeneración y transformación para producir plantas transgénicas de albaricoquero con secciones de hipocotilo y cotiledones a partir de semillas maduras de las variedades de albaricoquero ¿Canino¿, ¿Moniquí¿ y ¿Dorada¿ y de la subespecie de albaricoquero, Prunus armeniaca L. var. ansu Maxim, cuyas semillas se utilizan para producir patrones para albaricoquero y otros frutales en China. Se ha conseguido establecer un protocolo de regeneración con los cotiledones de semillas de ¿Canino¿ y del patrón, Prunus armeniaca L. var. ansu Maxim obteniendo porcentajes de regeneración muy elevados (66%) que no se vieron afectados por el genotipo. Sin embargo, la falta de coincidencia de las células que regeneran con las células que son transformadas por Agrobacterium ha impedido la obtención de plantas transformadas hasta el momento. Utilizando los explantos de secciones de hipocotilos de semillas maduras de tres variedades comerciales de albaricoquero, ¿Dorada¿, ¿Moniquí¿ y ¿Canino¿, se ha 6 establecido un protocolo de regeneración eficiente, con un mínimo del 32% de regeneración para las tres variedades estudiadas, que ha permitido abordar experimentos de transformación. Además, se han conseguido plantas transgénicas de las variedades ¿Dorada¿ y ¿Moniquí¿. El principal interés de la transformación genética de especies frutales reside en la posibilidad de transformar variedades comerciales con interés agronómico y ampliamente aceptadas. Sin embargo, para que la transformación genética se convierta en una herramienta de uso común en los programas de mejora de frutales leñosos se requiere que los procedimientos sean reproducibles, de elevada eficiencia e independientes del genotipo. La utilización de material adulto garantiza la identidad genética del material vegetal y evita los problemas de juvenilidad en aquellas especies en las que estos periodos son muy largos. Con el fin de explorar la posibilidad de desarrollar un protocolo de transformación independiente del genotipo, en esta tesis se ha estudiado el desarrollo de una nueva metodología basada en la transformación de células con capacidad meristemática. Se ha conseguido transformar cuatro variedades de albaricoquero, ¿Helena¿ ¿Canino¿, ¿Rojo Pasión¿ y ¿Lorna¿, con eficiencias de transformación que se encuentran entre las más elevadas descritas en especies de Prunus. Las ventajas de esta metodología son la sencillez del protocolo utilizado, su consistencia y rapidez. Sin embargo, hemos detectado que con mucha frecuencia se producen plantas quiméricas al transformar las células meristemáticas. Otro inconveniente en los protocolos de transformación es la utilización de genes marcadores. Estos genes producen un rechazo social e incluso existe una directiva europea (2001/18/CE) que regula las plantas transformadas con genes de resistencia a antibióticos. El uso del gen pmi como marcador de selección podría reducir el rechazo de la opinión pública y facilitar los tramites legales para la comercialización de plantas transgénicas, ya que la proteína que codifica este gen no representa un riesgo para la salud humana ni para el medio ambiente. En la presente tesis se ha estudiado el desarrollo de un protocolo de transformación genética de albaricoquero que utiliza el sistema pmi/manosa para seleccionar las plantas transformadas. Con este sistema se ha conseguido producir plantas transgénicas de albaricoquero con una eficiencia similar a la obtenida con genes marcadores de selección que confieren resistencia a antibióticos, demostrando que puede ser un sistema de selección alternativo al uso de antibióticos. 7 SUMMARY Apricot (Prunus armeniaca L.) is one of the most economically relevant species, within the stone fruit trees, in Mediterranean countries. Breeding programmes are aimed to produce new cultivars with high fruit quality, extended ripening time, self-compatibility and virus resistance. Genetic engineering may allow the production of new improved cultivars by mean of discrete changes in a relatively short period. Most of developed transformation procedures for Prunus species use juvenile material from seeds. Among them, a very high efficient Agrobacterium-mediated transformation protocol from plum hypocotyls can be highlighted. In the present work we studied the possibility of developing a similar Agrobacterium-mediated transformation protocol of mature seed-derived tissues from apricot. Such methodology would allow the confirmation of an hypothesis when there is no need or interest in producing improved cultivars (i.e. testing new constructions or developing protocols for marker genes elimination), and also would be useful for functional genomic studies by evaluating the activity of genes in this species. Furthermore, it will be of interest for producing transgenic rootstocks, since most apricot cultivars are grafted onto apricot seedlings. Other advantage of this methodology is that mature seeds can be available during long periods of time under cold storage conditions. Mature seed hypocotyl slices or cotyledons from the apricot cultivars ¿Canino¿, ¿Dorada¿, ¿Moniquí¿ and apricot subspecies Prunus armeniaca L. cv. ansu Maxim, used as apricot rootstocks in China, were used as the source of explants. Adventitious shoot regeneration from apricot mature seeds cotyledons from ¿Canino¿ and the rootstock, Prunus armeniaca L. cv. ansu Maxim, has been achieved in high percentages (66%), which were not affected by genotype. However, transgenic plants have not been recovered due to lack of coincidence between cells regenerating and those transformed by Agrobacterium. An efficient regeneration protocol from the cultivars ¿Canino¿, ¿Moniquí¿ and ¿Dorada¿ have been established using mature seeds hypocotyl slices, with regeneration percentages higher than 32% for all cultivars, which has allowed transformation experiments. Furthermore, transgenic plants of ¿Dorada¿ and ¿Moniqui¿ cultivar were produced. 8 Plant transformation could be a powerful tool for fruit breeding if transformation procedures for elite and commercially appreciated cultivars was available. Gene transfer technologies should be reproducible, efficient and genotype-independent. Transformation of adult material guaranties genetic identity of transgenic plants and avoids long juvenile periods. In this Ph.D. thesis a methodology to develop such a procedure has been studied, based in cells with meristematic capability. We have transformed the apricot cultivars ¿Helena¿ ¿Canino¿, ¿Rojo Pasión¿ and ¿Lorna¿, with transformation efficiencies, based on PCR analysis, among the highest reported after transformation of other Prunus species. The advantages of this methodology are that is simple, fast and consistent. However, a large frequency of chimerical plants has been detected when transforming meristematic cells. Another problem of most transformation procedures is that they use marker genes. These produce a social rejection and there is an European law that neither allow deliberate release of plants carrying antibiotic resistance genes, used in veterinary or medicine, after 2004 nor their commercialisation after 2008 (Directive 2001/18/EEC of the European Parliament and the Council of the European Union). Since the PMI protein has revealed no adverse effects on human health and on the environment, the use of the pmi gen as a selectable marker could reduce the social rejection, facilitating legalisation and commercialisation of transgenic plants. In this Ph.D. thesis we have evaluated a transformation procedure using the pmi/mannose system for selecting apricot transgenic plants. Transformation efficiencies were similar to those obtained using antibiotic selection, demonstrating that this system could be an alternative for producing apricot transgenic plants under safe conditions for human health and the environment.