Caracterización molecular y celular de la biosíntesis y composición de la zona pelúcida de ovocitos de hámster (Mesocricetus auratus). Análisis filogenético de la glicoproteína ZP4 en la subfamilia Murinae

Resumo

Los ovocitos de mamíferos están rodeados de una matriz extracelular llamada zona pelúcida (ZP) que está involucrada en diferentes procesos durante la fecundación y desarrollo embrionario temprano. Esta matriz está involucrada en el reconocimiento y unión al espermatozoide, en la reacción acrosómica, bloqueo de la polispermia y en la protección del embrión preimplantado (Yanagimachi, 1994; Epifanio et al., 1994; Benoff, 1997; Wassarman, 1998; Denker, 2000; Herrler y Beier, 2000; Sinowatz et al., 2001; Dean, 2004; Hoodbhoy y Dean, 2004; Wassarman y Litscher, 2008). A pesar de la importancia del papel jugado por la ZP todavía quedan diferentes aspectos sin aclarar sobre su composición, estructura, origen y filogenia. En la presente Tesis Doctoral se abordan algunos de los aspectos anteriormente mencionados como la composición y origen de la ZP de ovocitos de hámster. Además, se inicia un estudio desde el punto de vista evolutivo de la proteína ZP4 en roedores y concretamente en la subfamilia Murinae. A continuación se describen brevemente los experimentos realizados y resultados obtenidos: I. Análisis de la composición de la zona pelúcida de hámster. La composición de la ZP ha sido descrita en diferentes especies y está constituida por 3 a 6 glicoproteínas dependiendo de la especie analizada (Bleil y Wassarman, 1980; Hedrick y Wardrip, 1987; Lefièvre et al., 2004; Hoodbhoy et al., 2005; Ganguly et al., 2008; Goudet et al., 2008). En mamíferos, se ha considerado que la ZP está compuesta por tres glicoproteínas: ZP1, ZP2 y ZP3 tomando como modelo la ZP murina (Bleil y Wassarman, 1980). Sin embargo, la descripción del genoma completo en algunas especies como el hombre o la rata ha dado lugar a la detección de nuevas proteínas en la ZP. Estudios recientes revelan que algunos mamíferos presentan una ZP formada por cuatro glicoproteínas como en el hombre (Lefièvre et al., 2004) o la rata (Hoodbhoy et al., 2005). Estas cuatro glicoproteínas se designan como ZP1, ZP2 (ZPA), ZP3 (ZPC) y ZP4 (ZPB). La presencia de una cuarta glicoproteína en la composición de la ZP nos hace replantearnos los diversos modelos de composición y estructura de la ZP propuestos hasta la fecha. En el hámster, especie objeto de nuestro estudio, la caracterización de la ZP mediante SDS-PAGE sugería la presencia de tres glicoproteínas diferentes: ZP1, ZP2 y ZP3 (Moller y Wassarman, 1990). Sin embargo, solamente ZP2 y ZP3 habían sido clonados (números de acceso en el GenBank: AY876920 (ZP2) y M63629 (ZP3)). En este estudio, mediante técnicas de biología molecular y proteómica se analiza la composición de la ZP de hámster detectándose la presencia de cuatro glicoproteínas: ZP1, ZP2, ZP3, y ZP4. El ARNm de ZP1 y ZP4 es amplificado y secuenciado demostrándose su presencia en el ovario de hámster. Por otro lado, mediante técnicas de espectrometría de masas probamos la traducción del ADNc codificante de ZP1 y ZP4 ya que se detectan diferentes péptidos pertenecientes a estas dos proteínas. Además se detectan péptidos de ZP2 y ZP3, las otras glicoproteínas cuyas secuencias de nucleótidos y aminoácidos se encuentran en la base de datos (GenBank). Además, realizamos un análisis comparativo de la secuencia del ADNc y proteica de ZP1 y ZP4 con respecto a las glicoproteínas de la ZP de otras especies. Este análisis muestra la existencia de una alta homología de estas glicoproteínas con las glicoproteínas de la ZP de otras especies revelando además la presencia de motivos comunes como el péptido señal, dominio trefoil, dominio ZP, dominio transmembrana y sitio consenso para el corte de furina. II. Estudio del origen celular de las glicoproteínas de la zona pelúcida de hámster El origen celular de las proteínas de la ZP de las especies mamíferas ha sido motivo de controversia durante largo tiempo. Dependiendo de la especie, las proteínas de la ZP son sintetizadas por: a) el ovocito, b) las células foliculares o c) ambos (ovocito y células foliculares) (Kölle et al., 1996, 1998; Sinowatz et al., 2001; Bogner et al., 2004). La síntesis de la ZP sólo a nivel del ovocito ha sido demostrada en ratón y rata (Bleil y Wassarman, 1980b; Skinner y Dunbar, 1992; Epifano et al., 1995; Scobie et al., 1999; Sinowatz et al., 2001; El Mestrah et al., 2002) mientras que en otros mamíferos (hombre, cerdo, conejo, perro y vaca) la expresión de las proteínas de la ZP ha sido detectada también a nivel de las células de la granulosa. En este estudio, mediante técnicas de hibridación in situ analizamos el patrón de expresión de las proteínas de la ZP en el ovario de hámster. Los resultados obtenidos revelan que la síntesis de las cuatro glicoproteínas (ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4) de hámster tiene lugar de forma exclusiva en el ovocito. No hay expresión proteica en las células foliculares. En cuanto a los niveles de expresión de las cuatro glicoproteínas, los ovocitos de los folículos primordiales y los primarios de menor tamaño son los que muestran una mayor expresión disminuyendo conforme el folículo aumenta de tamaño. La expresión fue muy débil o nula en los ovocitos pertenecientes a los folículos preovulatorios o de Graaf. III. Estudio de la expresión y vía de secreción de ZP4 de hámster en células HEK 293T Para el estudio de la expresión y vía de secreción de ZP4 de hámster se procedió a la clonación de la misma y transfección posterior en células HEK 293T. Nuestros resultados nos indican que la proteína es expresada en este sistema celular con alta eficacia siendo imposible su detección en el medio de cultivo como proteína secretada. Mediante ensayos de citometría de flujo y microscopía confocal, ZP4 de hámster se muestra anclada a nivel de la membrana celular de manera que podemos afirmar que el tráfico desde el retículo hasta la superficie celular es adecuado y concuerda con el comportamiento seguido por otras proteínas de la ZP descritas previamente (Litscher et al., 1999; Kiefer y Saling, 2002). No obstante, el hecho por el cual no es secretada permanece sin ser esclarecido pero parece estar en concordancia con algunos resultados obtenidos en estudios previos realizados con proteínas recombinantes de la familia ZPB (ZP1 y ZP4) (Tsubamoto et al., 1999; Martic et al., 2004) El análisis por SDS-PAGE y Western-blot revela un peso molecular de la proteína recombinante obtenida de la lisis celular de aproximadamente 75 kDa. Teniendo en cuenta que el peso esperado de la proteína nativa madura es de 59,946 kDa, el peso de la proteína recombinante obtenida coincide con el peso esperado que tendría la proteína sin el péptido señal y con el dominio transmembrana más la glicosilación (ZP4 presenta 6 sitios potenciales de N- glicosilación), asumiendo un procesamiento similar al de otras glicoproteínas de la ZP (Litscher et al., 1999; Kiefer y Saling, 2002). IV. Análisis filogenético de ZP4 en la subfamilia Murinae En esta Tesis Doctoral mostramos los resultados obtenidos a partir de un análisis filogenético de ZP4 realizado dentro de la subfamilia Murinae. Esta proteína ha sido poco estudiada desde el punto de vista evolutivo siendo interesante resaltar la necesidad de un análisis de la misma debido a su importancia funcional en especies como el bovino, el porcino o el hombre. Además dentro de esta subfamilia encontramos una especie, Mus musculus en la que está proteína no es expresada. El gen ha sufrido a lo largo de la evolución una serie de deleciones e inserciones que impiden la lectura completa del ARNm codificante para dicha proteína (pseudogen). Debido a que ZP4 si se expresa en otro taxón dentro de la subfamilia, en Rattus norvegicus, podemos afirmar que ZP4, como proteína funcional, se ha perdido en algún punto del árbol evolutivo desde la divergencia de Mus y Rattus a partir de un ancestro común. En nuestro estudio amplificamos y analizamos diferentes regiones de interés dentro de ZP4 tomando como molde el ADN genómico de 25 taxones pertenecientes a la subfamilia Murinae. El análisis reveló que la pseudogenización de ZP4 podría afectar solamente al subgénero Mus. Para la confirmación de la existencia de una secuencia codificante completa para ZP4 en determinadas especies se procedió a la amplificación de esta secuencia a partir de ADNc obtenido a partir de ARN de ovario. Hasta la fecha, las secuencias obtenidas no revelan la presencia de codones de stop de manera que la pseudogenización de ZP4 puede datarse hace unos 4 millones de años.