Caracterizacion en roedores adultos de la población de células ganglionares de retina melanopsínicas y estudio de la degeneración de las células ganglionares tras hipertensión ocular y neuroprotección

Resumen

D. Francisco Javier Valiente Soriano "Caracterización en roedores adultos de la población de células ganglionares de retina melanopsínicas y estudio de la degeneración de las células ganglionares tras hipertensión ocular y neuroprotección". RESUMEN Objetivos " Caracterizar la población de CGRm del ratón pigmentado y albino adulto. " Estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO en ratón pigmentado. " Estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO y su protección con BDNF en rata albina adulta. Material y métodos Para la realización de los experimentos se utilizaron ratones machos pigmentados y albinos adultos y ratas hembras adultas albinas. Las manipulaciones de los animales se realizaron siguiendo la normativa europea (Directiva 2010/63/UE) y nacional (RD 53/2013) sobre la protección de los animales utilizados para la experimentación y otros fines científicos. Para caracterizar la población de CGRm del ratón pigmentado y albino adulto, se inmunodetectaron secciones transversales de retina y retinas a plano con el anticuerpo contra la melanopsina, con el anticuerpo contra Brn3a y se contratiñeron los núcleos de todas las células de la retina con DAPI. Para estudiar la proyección de las CGRm, se aplicó en ambos CS o en el muñón del nervio óptico el trazador neuronal OHSt. Para estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO en ratón pigmentado, se caracterizó el modelo de HTO fotocoagulando con láser las venas perilimbares y epiesclerales del ratón. Para analizar el curso temporal de daño axonal y muerte de las CGR y las CGRm, las CGR fueron trazadas retrógradamente desde los CS con OHSt, las retinas se inmunodetectaron con Brn3a y melanopsina, y se analizaron a las 2 y 4 semanas. Para estudiar la degeneración de las CGR y las CGRm después de HTO y su protección con BDNF en rata albina adulta, se analizó el curso temporal de daño axonal y muerte de las CGR y CGRm tras HTO en retinas tratadas con BDNF o vehículo. Las CGR fueron trazadas retrógradamente desde los CS con FG, y las retinas se inmunodetectaron con Brn3a y se analizaron a 12 y 15 días tras la inducción de la HTO. Para el análisis estadístico, el test Kruskal-Wallis se utilizó cuando se compararon dos o más grupos y el test Mann-Whitney cuando se compararon dos grupos solamente. Las diferencias entre grupos se consideraron estadísticamente significativas para p<0.05. Resultados Los ratones pigmentados y albinos tienen un número similar de CGRm (1.021±109 CGRm pigmentado y 962±169 CGRm albino). En los ratones pigmentados las CGRm son más abundantes en la retina tempora y en los albinos están más localizadas en la retina superior. Ambos ratones también tienen CGRm desplazadas (CGRm-d) en la capa nuclear interna, que representan el 14% del total de CGRm en ratones pigmentados y el 5% en los albinos. El marcaje desde ambos CS muestra que el 98% (pigmentado) y el 97% (albino) de la población total de CGRm se marcan retrógradamente, mientras que el estudio de colocalización de melanopsina y Brn3a confirma que un porcentaje muy pequeño de CGRm expresa este factor de transcripción en ratones. En el estudio del marcaje retrógrado colocando OHSt en el muñón del nervio óptico demuestra que no todas las CGRm eran trazadas. Existía una subpoblación de CGRm-d (14% en pigmentados y 28% en albinos) y CGRm residentes en la zona ciliar marginal de la retina (20% en pigmentados y 24% en albinos) que no se trazaban desde el nervio óptico; por lo que estas células no envían el axón a través del nervio óptico y pueden ser consideradas interneuronas de la retina, quizá relacionadas con el reflejo pupilar intrínseco. En el estudio de la caracterización del modelo de hipertensión ocular en el ratón pigmentado observamos un aumento significativo de la presión intraocular desde las primeras 6 horas de la fotocoagulación láser hasta los 5 días. En ratón pigmentado, la HTO resulta en una pérdida difusa y/o sectorial de CGR trazadas con el trazador neuronal OHSt (CGR OHSt+) (50% a 2 semanas y 62% a 4 semanas). Sin embargo, a las 2 semanas aún se observa un 66% de CGR marcadas con Brn3a (CGR Brn3a+). Esto indica que sobreviven en la retina aproximadamente un 16% de CGR cuyo transporte axonal retrógrado está comprometido. Parte de estas CGR acaban muriendo y a las 4 semanas el número de CGR trazadas con OHSt e inmunodetectadas con Brn3a se iguala. La población de CGRm disminuyó aproximadamente al 59% a las 2 semanas y al 46% a las 4 semanas, valores similares a los de las CGR Brn3a+ para los mismos tiempos. La distribución topográfica de la pérdida de CGRm, aunque era mayor en la zona supero-temporal de retina, no era sectorial, sino difusa a lo largo de la retina y no se complementaba con la distribución de la pérdida del resto de CGR. En rata albina, la HTO resulta en una pérdida sectorial de las CGR FG+ (78 y 84% a los 12 y 15 días, respectivamente). El número de CGR Brn3a+ fue significativamente mayor para ambos tiempos de estudio, esto indica que una proporción considerable (?21 - 26%) de CGR sobreviven en la retina con su transporte axonal retrógrado deteriorado. Las CGRm también presentaron una disminución significativa (50-51%) y esta pérdida, al igual que en ratón, fue difusa. La administración intravítrea de BDNF aumentó la supervivencia de las CGR Brn3a+ a 81 y 67% a los 12 y 15 días, respectivamente, pero no tuvo ningún efecto sobre las CGRm. D. Francisco Javier Valiente Soriano "Characterization in adult rodents of the melanopsin retinal ganglion cells population and study of the retinal ganglion cells degeneration after ocular hypertension and neuroprotection" SUMMARY Objetives " Characterization of the mRGC population of adult pigmented and albino mouse. " Study the RGC and mRGC degeneration after OHT in the pigmented mouse. " Study the RGC and mRGC degeneration after OHT and their protection with BDNF in adult albino rat. Material and methods To perform the experiments we used adult pigmented mice, adult albino mice and female adult albino rats. Manipulations of animals were carried out according to the European (Directive 2010/63/UE) and National (RD 53/2013) regulations existing on the protection of animals used for experimentation and other scientific purposes. To study the characterization of the mRGC population of adult pigmented and albino mouse, cross sections of retina and whole mounts were immunoreacted with anti-melanopsin antibody, with anti-Brn3a antibody and stained with DAPI. To study the projection of the mRGC, the neuronal tracer OHSt was applied in both SC or in the optic nerve. To study the RGC and mRGC degeneration after OHT in the pigmented mouse, ocular hypertension model was performed by laser photocoagulation of the perilimbar and epiescleral veins of the experimental eye. To study the time course of the axonal damage and RGC and mRGC death caused, the RGC were traced from the SC with OHSt and retinas were immunodetected with Brn3a and melanopsin and analyzed at 2 and 4 weeks. To study the RGC and mRGC degeneration after OHT and their protection with BDNF in adult albino rat, we analyzed the time course of the axonal damage and RGC and mRGC death after OHT in BDNF or vehicle-treated retinas, RGC were retrogradely traced from the SC with the retrogradely transported tracer fluorogold (FG), retinas were immunodetected with Brn3a and analyzed at 12 and 15 days after the induction of OHT. For statistical analysis, Kruskal-Wallis test was used when comparing more than two groups and Mann-Whitney when comparing two groups only. Differences were considered significant when p<0.05. Results Both pigmented and albino mice have a similar number of mRGC (1,021±109 mRGC in pigmented, 962±169 mRGC in albino). The mRGC are most abundant in the temporal retina in pigmented mice, and in dorsal retina in albino mice. Both mice also have displaced mRGC (d-mRGC) located in the inner nuclear layer representing 14% of the total population of mRGC in pigmented mice and 5% in albino mice. The 98% (pigmented) or 97% (albino) of the total population of mRGC were marked retrogradely from both SC, while the colocalization study of melanopsin and Brn3a confirms that a very small percentage of this transcription factor was expressed by mice mRGC. A surprising fact in the study of retrograde labeling with OHSt applied on the ON stump was that not all the mRGC were traced. A subpopulation of d-mRGC (14% in pigmented and 28% in albino) and mRGC located in the ciliary marginal zone of the retina (20% pigmented and 24% in albino) that were not traced from the optic nerve, that means that these cells do not send an axon into the optic nerve and can be considered an interneuron of the retina, perhaps related to the intrinsic pupil reflex. In the study of the characterization of ocular hypertension model in pigmented mouse, a significant increase of the intraocular pressure (IOP) was observed from 6 hours of laser photocoagulation up to 5 days. OHT results in a sectorial and/or diffuse loss of RGC traced with OHSt (OHSt+RGC) (50% at 2 weeks and 62% at 4 weeks). However, at 2 weeks, 66% of RGC, which were immunodetected with Brn3a (Brn3a+RGC) were still present. This indicates that at this time around 16% of RGC survive in the retina with their retrograde axonal transport committed. These RGC, however, died at 4 weeks and the number of traced OHSt+RGC and immunodetected Brn3a+RGC was equal. The mRGC population decreased to 59% at 2 weeks and to 46% at 4 weeks. These percentages of loss were similar to the Brn3a+RGC at the same time points. The loss of the mRGC was higher in the supero-temporal area of the retina. However, this loss was not sectorial, but was diffuse along the retina, and did not parallel the distribution of loss of the rest of RGC. In albino rat, OHT resulted in a sectorial loss of FG+RGC (78-84% at 12 and 15 days, respectively). The number of Brn3a+RGC was significantly higher in both times of study, which indicates that a significant proportion (?21-26%) of RGC survive in the retina with their impaired retrograde axonal transport. The mRGC also presented a significant reduction of approximately 50-51%, and this loss, as in mice, was diffuse. The intravitreal administration of BDNF increased the Brn3a+RGC survival to 81% and 67% at 12 and 15 days, respectively, but had no effect on the mRGC. The study of the inner retinal vasculature did not show any abnormality that could explain the sectorial loss of RGC.