Genómica evolutiva en cicindélidoscaracterización y análisis de expresión de genes relacionados con la reproducción y el sistema inmune

Abstract

Los cicindélidos o escarabajos tigre son una familia de coleópteros depredadores pertenecientes al suborden Adephaga que cuentan con más de 2500 especies distribuidas por todo el mundo. Son especies importantes en los ecosistemas y comúnmente usadas como bioindicadores que han despertado la curiosidad de científicos y aficionados y han sido frecuentemente estudiados a distintos niveles. Sin embargo, hay poca información sobre los transcriptomas de los cicindélidos, y no se han realizado estudios para identificar y caracterizar los genes que podrían estar involucrados en el proceso evolutivo. El objetivo principal de esta tesis es identificar, caracterizar y analizar en un contexto evolutivo genes relacionados con la reproducción y el sistema inmune en cicindélidos. Para ello se han analizado genotecas de EST de distintos escarabajos tigre (Calomera littoralis, Cephalota litorea y Cicindela campestris). En el primer capítulo se realizan análisis bioinformáticos y de expresión diferencial entre machos y hembras, identificándose cuatro posibles proteínas del fluido seminal (Acp01-Acp04). Se realiza también una búsqueda de homología mediante RT-PCR en otras especies de cicindélidos para inferir el tipo de evolución de cada proteína. AcpC03 únicamente amplificó en C. littoralis y Lophyra flexuosa especies que guardan una estrecha relación filogenética y por tanto se trataría de una proteína de rápida evolución. AcpC04 y Acp01 amplifican en todas las especies de cicindélidos analizadas, por lo que se trata de proteínas conservadas al menos en los escarabajos tigre. En el segundo capítulo se realizan análisis bioinformáticos para caracterizar en Cicindela campestris dos modificadores post traducción, la enzima de conjugación E2 SUMO (Cc-UBC9) y una proteína de fusión ubiquitina-ribosómica (Cc-UBS27). Los análisis de selección realizados tras la amplificación de estos genes en siete especies de cicindélidos revelaron que ambos genes están sometidos a selección purificadora, lo que pondría de manifiesto la importancia de la función de estas proteínas. Los análisis de expresión génica mediante RT-qPCR mostraron los mayores niveles de expresión en gónadas en comparación con el resto de tejidos analizados para ambos genes, lo que indica que juegan un papel activo en la gametogénesis de los cicindélidos. Adicionalmente la mayor expresión de estos genes en testículo inmaduro, en relación al estadio maduro, indica que estos genes están involucrados en mayor medida en las etapas tempranas de la gametogénesis. En el tercer capítulo se realizan análisis bioinformáticos para identificar una defensina en Calomera littoralis (Clit-Def). Los análisis estructurales y bioinformáticos sugirieren que Clit-Def tiene capacidad antimicrobiana y por tanto está involucrada en el sistema inmune. Adicionalmente, los análisis de expresión de estos genes mediante RT-qPCR revelaron que Clit-Def en C. littoralis se sobre expresa en diferentes tejidos, principalmente en abdomen, tras la infección con lipopolisacáridos de Escherichia coli, lo que sugiere que este gen juega un papel importante en la respuesta humoral. El análisis filogenético de la defensina de este trabajo junto con las de otros coleópteros obtenidas de GenBank mostró que las defensinas no se agrupan en clados congruentes con la taxonomía lo que indica que se trata de proteínas de alta diversidad. La descripción de estos genes proporciona información relevante sobre la biología de los cicindélidos, y también sirve de base para entender mejor su proceso de diversificación, lo que conduce a una mayor comprensión de sus relaciones filogenéticas y aporta indicios sobre los procesos de especiación. Summary Cicindelids or tiger beetles are a family of predatory beetles belonging to the suborder Adephaga, which have more than 2500 species worldwide distributed. They are important in ecosystems and are species commonly used as bioindicators that have provoked the curiosity of scientists and amateurs, and therefore they have been deeply studied at different levels. Nevertheless, there is little information on the transcriptomes of tiger beetles, and no studies have been conducted to identify and characterise genes that could be involved in the evolutionary process. The objective of this thesis is to identify, characterise and analyse reproductive and immune related genes in cicindelids from an evolutionary perspective. To achieve this objective EST libraries from different tiger beetles (Calomera littoralis, Cephalota litorea and Cicindela campestris) has been analysed. In the first chapter bioinformatic analyses and differential expression analyses between males and females are performed, identifying four putative seminal fluid proteins (Acp01-Acp04). Homology searches in other tiger beetle species, using RT-PCR, have been performed to infer the evolution of these proteins. AcpC03 only amplified in C. littoralis and Lophyra flexuosa, species that are phylogenetically closely related and thus, it is consider a rapidly evolving protein. Acp01 and AcpC04 amplified in all cicindelid species analysed so they seem most likely to be conserved proteins at least in one group of tiger beetles. In the second chapter, bioinformatic analysis was performed to characterise two post-translation modifiers, the SUMO conjugating enzyme E2 (Cc-UBC9) and a ubiquitin-ribosomal fusion protein (Cc-UBS27) in Cicindela campestris. Selection analyses, performed after amplification of these genes in seven species of tiger beetles, revealed that both genes are under purifying selection what highlights the importance of these proteins. The gene expression analysis by RT-qPCR showed for both genes the highest levels of expression in gonads compared with other tissues analysed, indicating that they play an active role in gametogenesis in cicindelids. Additionally, the higher expression of these genes in immature testis relative to mature stages, indicates that these genes are mostly involved in the early stages of gametogenesis. In the third chapter, bioinformatic analyses are performed to identify a defensin gene in Calomera littoralis (Clit-Def). Structural and bioinformatic analyses suggested that Clit-Def has antimicrobial activity and therefore is involved in the immune system. Additionally, expression analysis of these genes via RT-qPCR, revealed that Clit-Def is overexpressed in C. littoralis, after infection with Escherichia coli lipopolysaccharides, in different tissues and mainly in the abdomen, suggesting that this gene plays a role in the humoral response. Phylogenetic analysis using the defensin characterised in this work (Clit-Def) together with other coleopteran defensins obtained from GenBank, showed that they are not grouped into clades congruent with the taxonomy, indicating that defensins are highly diverse proteins. The description of these genes provides important information on the tiger beetles biology, and also provides a foundation to better understand their diversification process, leading to a better comprehension of their phylogenetic relationships and providing clues on speciation processes.