Nuevos aspectos en las actividades catalíticas de tirosinasa

Abstract

Resumen: Objetivos: el objetivo fundamental de esta Memoria consiste en profundizar en el mecanismo de acción de la tirosinasa. Se centra la atención de este estudio sobre la actividad monofenolasa y se profundiza en el proceso de inactivación suicida. Se investiga la aportación de cada una de las actividades monofenolasa y difenolasa en dicho proceso. Se aborda la caracterización cinética de monofenoles de interés fisiológico. Metodología: 1. Profundizar en el mecanismo cinético de actuación de la enzima en sus actividades monofenolasa y difenolasa. 2. Estudiar la hidroxilación de umbeliferona a esculetina en la ruta de biosíntesis de cumarinas. 3. Establecer una metodología para investigar si un monofenol es inhibidor o sustrato alternativo de la enzima con la ayuda del peróxido de hidrógeno. 4. Diferenciar las actividades monofenolasa y difenolasa en su implicación en el proceso de inactivación suicida. 5. Profundizar en el estudio del mecanismo de inactivación suicida de la enzima en su acción sobre o-difenoles mediante la determinación del efecto isotópico generado en un medio deuterado. 6. Estudiar y analizar los procesos de catálisis e inactivación en la acción de tirosinasa sobre tres tipos de sustratos: o-difenoles, o-aminofenoles y o-fenilendiaminas. 7. Estudiar la acción de tirosinasa sobre hidroxihidroquinona en los procesos de catálisis e inactivación. 8. Estudiar la reacción de tirosinasa con hidroquinona, un monofenol, utilizado como despigmentante. 9. Caracterizar cinéticamente a hidroquinona como un sustrato de tirosinasa con la ayuda del peróxido de hidrógeno. 10. Estudiar la influencia de ácido ascórbico sobre el proceso de hidroxilación de hidroquinona por tirosinasa. 10. Caracterizar cinéticamente a hidroquinona como un sustrato de tirosinasa con la ayuda de cantidades catalíticas de o-difenol y ácido ascórbico. Resultados: 1. Se ha demostrado que tirosinasa podría participar en la ruta de biosíntesis de cumarinas hidroxilando umbeliferona a esculetina. 2. Peróxido de hidrógeno ayuda a demostrar si un monofenol es sustrato o inhibidor de tirosinasa actuando sobre la forma (metatirosinasa) y transformándola en la forma (oxitirosinasa). 3. Los estudios cinéticos con TBF/TBC demuestran que la enzima se inactiva únicamente al actuar sobre o-difenoles. 4. Un conjunto de estudios de efecto isotópico con D2O han puesto de manifiesto que existe una etapa muy lenta en la que se transfiere un protón. Esta etapa podría ser previa a la inactivación suicida. 5. La catálisis de la oxidación de o-difenoles, o-aminofenoles y o-fenilendiaminas, sigue un mecanismo similar: oxidación/ reducción simultánea sobre los dos átomos de cobre. 6. El proceso de inactivación suicida en la acción de la enzima sobre estos sustratos parece seguir un mismo mecanismo, que podría ser la oxidación/ reducción de uno de los átomos de cobre. 7. Los efectos electrónicos de los sustituyentes de C-4 de o-difenoles, o-aminofenoles y o-fenilendiaminas en las etapas de catálisis e inactivación son más importantes en los o-difenoles y o-aminofenles. 8. El producto de hidroxilación de hidroquinona, la hidroxihidroquinona, es un sustrato suicida de la enzima. 9. Se ha puesto de manifiesto que hidroquinona, un agente despigmentante, es un sustrato de tirosinasa. 10. Se ha demostrado que tirosinasa actúa sobre hidroquinona en presencia de oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno, ya que este último pasa metatirosinasa (inactiva sobre hidroquinona) a oxitirosinasa (activa sobre hidroquinona). 11. También se ha puesto de manifiesto que tirosinasa actúa sobre hidroquinona en presencia de oxígeno y ácido ascórbico a altas concentraciones, por el paso de metatirosinasa a desoxitirosinasa. Del mismo modo, cantidades catalíticas de tert-butilcatecol y ácido ascórbico en concentraciones de orden micromolar consiguen la acción de tirosinasa sobre hidroquinona a través del paso de metatirosinasa a desoxitirosinasa. ABSTRACT Objectives: The main objective of this report is to deepen the mechanism of action of tyrosinase. The focus of this study is on the monophenolase activity and deepened in the process of suicide inactivation. The contribution of each of the monophenolase and diphenolase activities in this process is investigated. In this regard, the kinetic characterization of monophenols with physiological interest is studied. 1. Deepen in the kinetic mechanism of tyrosinase in their monophenolase and diphenolase activities. 2. Study the hydroxilation of umbelliferone to scueltin in the cumarin biosynthesis pathway. 3. Establish a methodology to investigate if one monophenol is inhibitor or alternative substrate of tyrosinase with the aid of hydrogen peroxide. 4. Discriminate between the monophenolase and diphenolase activities in its involvement on the suicide inactivation process. 5. Deepen the study of suicide inactivation process of tyrosinase in its action on o-diphenols through the determination of isotopic effect generated in a deuterated medium. 6. Study and analyse the catalysis and inactivation processes in the action of tyrosinase on tree types of substrates: o-diphenols, o-aminophenols and o-phenylendiamines. 7. Study the tyrosinase action on hydroxyhydroquinone in the catalysis and inactivation processes. 8. Investigate the action of tyrosinase on a monophenol, hydroquinone, used as lightening. 9. Kinetically characterize to hydroquinone as a substrate of tyrosinase with the aid of hydrogen peroxide. 10. Study the ascorbic acid influence on the hydroquinone hydroxylation process by tyrosinase. 11. Kinetically characterize to hydroquinone as a substrate of tyrosinase with the help of catalytic amounts of o-diphenol and ascorbic acid. Results: 1. It has been shown that tyrosinase could be involved in the biosynthesis pathway of the coumarins by the hydroxylation of umbelliferone to esculetin. 2. Hydrogen peroxide helps to demonstrate whether a monophenol is a substrate or an inhibitor of tyrosinase acting on the form (metatyrosinase) and converting it into the form (oxytyrosinase). 3. The kinetic studies with TBF / TBC show that the enzyme is only inactivated when it acts on o-diphenols. 4. A set of studies of the isotopic effect in D2O have shown that there is a very slow step in which a proton is transferred. It could be considered as a previous step of the suicide inactivation. 5. The catalysis of the oxidation of o-diphenols, aminophenols and o-phenylenediamines occurs through a similar mechanism: simultaneous oxidation / reduction of the two copper atoms. 6. The process of suicide inactivation in the action of the enzyme on these substrates seems to follow the same mechanism which could suppose the oxidation / reduction of one of the copper atoms. 7. The electronic effects of the substituents on the carbon atom C-4 of o-diphenols, o-aminophenols and o-phenylenediamines during the catalytic and inactivation steps are more significant in the case of the o-diphenols and o-aminophenols. 8. The product of the hydroxylation of hydroquinone, hydroxyhydroquinone, is a suicide substrate of the enzyme. 9. It has been shown that hydroquinone, a depigmenting agent, is a substrate of tyrosinase. 10. It has been shown that tyrosinase acts on hydroquinone in the presence of molecular oxygen and hydrogen peroxide because the latter converts metatyrosinase (inactive on hydroquinone) to oxytyrosinase (active on hydroquinone). 11. It has also been found that tyrosinase acts on hydroquinone in the presence of molecular oxygen and ascorbic acid at high concentrations, by transforming metatyrosinase to desoxytyrosinase. Similarly, catalytic amounts of tert-butylcatechol and ascorbic acid at micromolar concentrations induce the action of tyrosinase on hydroquinone by the conversion of metatyrosinase to desoxytyrosinase step.