Identificación y caracterización de mutantes de tomate (Solanum lycopersicum) afectados en el desarrollo reproductivo y en la tolerancia a estreses abióticos

Abstract

Resumen El siglo XXI plantea un nuevo reto para la agricultura: las predicciones de aumento de la población mundial exigen aumentar la productividad de los cultivos. La incidencia del cambio climático sobre regiones históricamente agrícolas es causa ya del descenso en el rendimiento agrícola, al estar afectados por el impacto creciente de estreses abióticos como la sequía y la salinidad. Una de las estrategias para abordar este desafío es la generación y análisis de colecciones de mutantes de especies vegetales de gran importancia agro-alimentaria como tomate para la identificación de genes y la disección de mecanismos implicados en el desarrollo y la producción así como en la tolerancia a estreses abióticos. Dentro del programa de mutagénesis insercional con T-DNA en tomate que se lleva a cabo entre los grupos de investigación del IBMCP, UAL y CEBAS, en este trabajo nos hemos centrado en la identificación de mutantes afectados en el desarrollo reproductivo, que en último extremo afecta a la producción de fruto, y en la respuesta a la salinidad y la sequía, por ser estreses abióticos tan importantes por su incidencia en el rendimiento final. En el primer caso se aborda la identificación y caracterización de un mutante de gran interés agronómico por su fenotipo afectado en el desarrollo reproductivo, denominado afs1 (abnormal fruit set-1). El mutante afs1 se caracteriza por presentar una mayor tasa de cuajado de fruto, reflejada en un marcado aumento del número de frutos que, aunque de menor tamaño, promueven una mejora significativa de la producción. Entre las características de afs1 cabe destacar que sus frutos son partenocárpicos y destacan por su mayor calidad debido a una mayor concentración de glucosa y fructosa, así como de ácido cítrico, que dan lugar a un incremento del índice de sabor. La mutación responsable de dicho fenotipo no se debe a una inserción de T-DNA si no a una mutación somaclonal generada durante la transformación y cultivo in vitro, algo ya observado en otras colecciones de mutantes insercionales, y se está procediendo a su localización genómica. En el segundo caso se aborda la caracterización de un mutante alterado en la respuesta al estrés salino e hídrico. El mutante se ha denominado wak1 (Wall-associated kinase 1), ya que la mutación responsable ha sido etiquetada por un inserto T-DNA que se sitúa en la región promotora del gen SlWAK1, que forma parte de un clúster génico de cuatro isoformas que están localizadas en el cromosoma 9, que codifican para unas proteínas quinasas asociadas a pared celular (cell wall-associated kinases). Aunque la expresión del gen SlWAK1 está anulada en el mutante, no lo están sin embargo los genes flanqueantes SlWAK2 y SlWAK3. El mutante wak1 presenta un fenotipo similar a la planta no transformada cuando se cultiva sin estrés, muestra un fenotipo sutil en condiciones de estrés hídrico y salino a medio plazo, y finalmente reduce significativamente el rendimiento en términos de producción de fruto en estrés a largo plazo. A nivel fisiológico, el mutante wak1 presenta mayor tolerancia al estrés iónico inducido por salinidad, con menor acumulación de Na+ en hoja. Sin embargo, el mutante es sensible al estrés osmótico inducido tanto por estrés salino como hídrico. Además, la anulación del gen SlWAK1 provoca una acumulación de sacarosa en raíz, relacionada con una alteración en la expresión de genes implicados en el metabolismo de sacarosa. Considerados en conjunto, los resultados de la caracterización de estos mutantes fenotípicamente tan diferentes demuestran el gran interés que tiene el análisis de mutantes para avanzar en el conocimiento de los procesos y los genes clave en el desarrollo y en la tolerancia a estreses abióticos. Abstract The XXI century poses new challenges to agriculture: the predictions of global population growth invite us to focus all our efforts on increasing crop yields. In turn, the impact of climate change on historically farming regions promotes the decrease of the performance of these vegetable species with high agronomic interest, such as the tomato, which is one of the most important global vegetable species. Among the strategies proposed to address the problems exposed, generating mutant collections is one of the most widespread strategies and it has provided much information about processes, pathways and relevant mechanisms. To this end, a collection of insertional mutants using an enhancer trapping has been created in the commercial cultivar of the tomato "Moneymaker" and we have directed our interest in selecting mutants affected in the reproductive development and in the response to abiotic stresses (salinity and drought) to be key processes that directly affect the final crop yield. Within the collection, we have identified a mutant with high agronomic interest related to reproductive development, which we have named afs1 (abnormal furit set-1), characterized by an increased vegetative growth rate and higher rate of fruit set. Their flowers show an opening in the base of the stamen caused by the early fruit set, initiated before the anthesis. The higher fruit set rate is reflected in the increase in fruits number, despite the smaller size, leading to a significant improvement in the production and final yield in greenhouse conditions. Among the characteristics of production, it is noteworthy that this afs1 produces parthenocarpic fruits with improved organoleptic characteristics, brought about by an increase in glucose and fructose, and citric acid therefore, leads to an increased rate of flavor. It has also been selected and characterized by a mutant response to salt and water stresses, named wak1 (Wall-associated Kinase 1) which carries a T-DNA inserted in the promoter region for canceling the SlWAK1 gene expression in the mutant. This gene is part of a gene cluster consisting of four total WAK isoforms genes in chromosome 9. qPCR expression analysis has indicated that the SlWAK1 expression is root specific and reduces its expression levels in response to salt stress . The two flanking SlWAK1 isoforms genes (referred to SlWAK3 and SlWAK2 in this paper) are not affected by the T-DNA insertion and have a similar pattern to the described for SlWAK1 response. At a phenotypic level, this mutant has a WT phenotype in standard culture conditions and displays a subtle phenotype under water and salt stresses, characterized by a significant reduction in the height rate of the aerial part, and the reduction of shoot water content. Paradoxically, despite the reduction in development, salt stress experiences have shown that the wak1 mutant has an increased tolerance to the accumulation of toxic concentrations of Na+ in the shoot. Furthermore, it has been shown that this mutant is sensitive to osmotic effect, which occurred in both the water stress and in the first phase of the salt stress. The results indicate that the basis of this sensitivity is an alteration in osmotic adjustment ability and in the sugar metabolism promotes an increased sucrose transport to the root at the expense of the growth rate and the transport of water toward the apex.