New markers of oxidative stress in dogs. Technical and applicative issues

Resumen

Los objetivos de esta tesis doctoral fueron aumentar el conocimiento sobre el posible uso y aplicaciones de los diferentes ensayos que pueden utilizarse para la determinación de la Capacidad Antioxidante Total (TAC) en perros y validar nuevos ensayos espectrofotométricos para evaluar TAC en suero de perros. Además, se buscó proporcionar una visión general de cómo el TAC medido por diferentes ensayos y otros marcadores de estrés oxidativo pueden comportarse en diferentes enfermedades del perro. Finalmente, se estudió la estabilidad de los diferentes ensayos de TAC, así como otros biomarcadores de estrés oxidativo en suero canino. En primer lugar, se investigaron los principales ensayos espectrofotométricos (capacidad antioxidante en equivalentes de Trolox [TEAC], capacidad antioxidante de reducción del ión cúprico [CUPRAC] y capacidad de reducción férrica del plasma [FRAP]) utilizados para evaluar el TAC en muestras de fluidos de perros mediante la revisión de la base metodológica de cada uno, su aplicación práctica en la determinación de TAC, y también proporcionar información existente en humanos para un fin comparativo. Posteriormente, se validó en suero de perro un ensayo automatizado para medición de CUPRAC, basado en la reducción de Cu2+ en Cu1+ por la acción de los antioxidantes no enzimáticos presentes en la muestra, tres ensayos automatizados para mediciones de TEAC, basados en la capacidad de una muestra para reducir el radical ABTS, y un ensayo automatizado para la medición de FRAP, basado en la capacidad de los antioxidantes presentes en la muestra para reducir la forma férrica (Fe3+) a su forma ferrosa (Fe2+). Para estudiar la aplicación de los marcadores de estrés oxidativo en diferentes enfermedades del perro, se utilizaron perros enfermos infectados naturalmente por leishmaniosis canina, perros con enfermedad inflamatoria intestinal idiopática (IBD), perros con ehrlichiosis (CME) clínica y subclínica y perros con dermatitis atópica (AD) inducida y no inducida por alimentos. Por último, seis pools de suero de perros sanos se dividieron en varias alícuotas y se almacenaron a 4°C y 25°C durante un período de 6, 24 y 72 h, y a -20°C y -80°C durante un período de 7, 14, 30, 60, 180 y 360 días. Además, se evaluó el efecto del ciclo de congelación-descongelación repetido. Los métodos validados permitieron la determinación de TAC con buena precisión, sensibilidad y exactitud y detectaron bajas concentraciones de este analito en la inflamación y la infección. Cuando se evaluaron biomarcadores en diferentes enfermedades, el TEAC, CUPRAC y el tiol total disminuyeron en suero de perros con leishmaniosis. Además, CUPRAC y tiol aumentaron después del tratamiento contra esta enfermedad. Los perros con IBD tenían una disminución del TEAC, CUPRAC y tiol total, y un aumento de biomarcadores oxidantes en el suero como FOX, TBARS y ROS. Los perros con CME clínica mostraron disminución de CUPRAC, FRAP, TEAC y tiol total y aumento de ROS. En el caso de CME subclínica, todos los biomarcadores presentaron diferencia entre perros enfermos y sanos con excepción del TEAC. En el caso de perros con AD, estos presentaron concentraciones disminuidas de CUPRAC, TEAC y tiol total y aumentadas de FRAP y de FOX en comparación con perros sanos. En el estudio de estabilidad, la mayoría de analitos fueron estables hasta 24 horas a 4ºC. En caso de almacenamiento a largo plazo, el uso de -80ºC proporcionó una mejor estabilidad que a -20ºC. Además, todos los biomarcadores se vieron afectados por tres ciclos de congelación-descongelación. Los ensayos automatizados validados en esta Tesis para la determinación de TAC en muestras de suero canino son simples, rápidos y fáciles de realizar, y se pueden adaptar fácilmente a analizadores bioquímicos automatizados. Se recomienda utilizar un panel integrado por una combinación de ensayos de TAC para evaluar el estado antioxidante de una muestra, ya que los resultados de TAC pueden ser marcadamente diferentes dependiendo del ensayo realizado. Cuando se evaluaron biomarcadores del estrés oxidativo en diferentes enfermedades del perro, como la leishmaniosis, la IBD, la CME y la AD, se observó que cada enfermedad presentaba cambios particulares en los biomarcadores evaluados. Además, en el caso de la leishmaniosis canina algunos biomarcadores como CUPRAC y tiol fueron útiles para la monitorización del tratamiento. Como los biomarcadores oxidativos individuales pueden mostrar diferencias en la estabilidad, es importante tener en cuenta las condiciones de almacenamiento y el analito a medir cuando se van a usar muestras almacenadas.