Estudio de la función plaquetaria y micropartículas plasmáticas en pacientes con hemofilia A en tratamiento profiláctico

Resumen

INTRODUCCIÓN: La Hemofilia A (HA) es una enfermedad hereditaria de trasmisión recesiva ligada al cromosoma X, que provoca un defecto en la hemostasia dando lugar a la aparición de hemorragias debido al déficit de factor VIII. En las formas graves (FVIII <1%) el sangrado puede ocurrir espontáneamente. Sin embargo, existe un 10% de pacientes con HA severa que expresan un fenotipo hemorrágico moderado o leve. OBJETIVOS: El presente trabajo está dirigido a la investigación de los factores moduladores del fenotipo hemorrágico en pacientes con HA severa tratados en régimen de profilaxis, entre ellos se encuentran las plaquetas y las micropartículas plasmáticas. Analizaremos si la administración de FVIII modifica este fenotipo hemorrágico, comparando una muestra basal (periodo de lavado/72h sin factor VIII) con respecto a una muestra 15 minutos tras administración de FVIII. Como objetivos secundarios, compararemos los resultados de la hipótesis principal con un grupo control de sujetos sanos, investigaremos la predisposición a eventos trombóticos en estos pacientes, valoraremos si el análisis de los factores moduladores de la hemostasia debe hacerse como rutina habitual en el estudio de un paciente con hemofilia A. MATERIAL Y MÉTODOS: La cohorte de este estudio observacional prospectivo longitudinal, aprobado por el Comité de Ética de Investigación Clínica del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca de Murcia, estaba representada por 16 pacientes de la Unidad de Hemofilia de la Región de Murcia con diagnóstico de Hemofilia A severa que se encontraban en tratamiento profiláctico con FVIII recombinante. Las extracciones analíticas se realizaban antes de la infusión de FVIII (72h sin administrar FVIII, muestra basal) y tras 15 minutos de la infusión de FVIII. Como grupo control se estudiaron 15 sujetos sanos.? La agregación plaquetaria fue determinada por: tiempo de obturación (PFA-100¿), agregación óptica (Chronolog¿), agregación por impedancia (Multiplate¿) y citometría de flujo (FACSCanto II¿). También estudiamos la expresión de marcadores de activación plaquetaria, como la p-selectina, el CD63, los agregados plaqueta-leucocito y plaqueta-factor tisular. Se analizó la cantidad de micropartículas (anexina V positivas) totales, de origen plaquetario (CD61), con expresión de p-selectina (CD62p) y de origen endotelial (CD144) mediante citometría de flujo con el sistema Beckman Coulter Gallios¿. Para ello, utilizamos el procedimiento estandarizado de selección de micropartículas con Megamix-Plus FSC (BioCytex), el cual contiene perlas fluorescentes de diámetros variados (0,1/0,3/0,5/0,9 ?m) para cubrir el rango teórico de las MP (0,1 a 1 ?m). Así mismo, también se analizó el Ca2+citosólico plaquetario. El análisis estadístico se realizó con el software informático SPSS 20.0. Para comparar las variables cuantitativas se utilizó la t de Student en caso de normalidad y la prueba de U de Mann-Whitney o de Wilcoxon en caso de no distribución normal. Las correlaciones se realizaron con el test de correlación de Pearson. Las variables cualitativas se analizaron mediante el test de distribución Chi-cuadrado de Pearson. El nivel de significación utilizado ha sido ? < 0,05. RESULTADOS Y CONCLUSIONES: En nuestro estudio no hemos encontrado diferencias significativas en la función plaquetaria de pacientes con HA severa en tratamiento profiláctico. Tampoco observamos afectación de la misma en relación a la infusión de FVIII. Los pacientes presentaron tras la administración de FVIII, menor cantidad de micropartículas de origen endotelial, por lo que este tratamiento no aumenta uno de los posibles marcadores de riesgo trombótico en estos pacientes. La cantidad de micropartículas plasmáticas totales y las de origen plaquetario estuvieron disminuidas en los pacientes con HA respecto al grupo de sujetos sanos. No consideramos indicado en la práctica clínica habitual la realización de estudios de agregación plaquetaria en pacientes con HA severa en régimen profiláctico. INTRODUCTION: Hemophilia A (HA) is a hereditary X-linked recessive transmission disease, which causes a defect in hemostasis leading to bleeding due to factor VIII deficiency. In severe forms (FVIII <1%) bleeding may occur spontaneously. However, there are 10% of patients with severe HA who express a mild or moderate haemorrhagic phenotype. OBJECTIVES: The present work is directed to the investigation of modulator factors of the hemorrhagic phenotype in patients with severe HA treated in a prophylaxis regimen, such as the platelets and plasma microparticles. We will analyze whether the administration of FVIII modifies this hemorrhagic phenotype by comparing a baseline sample (washing period / 72h without factor VIII) with a sample 15 minutes after FVIII administration. As secondary objectives, we will compare the results of the main hypothesis with a healthy control group, we will investigate the predisposition to thrombotic events in these patients, we will evaluate if the analysis of hemostasis modulator factors should be done as routine in the study of a patient with Hemophilia A. MATERIAL AND METHODS: This prospective longitudinal observational study, was approved by the Clinical Research Ethics Committee of the Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca Hospital in Murcia. The cohort was represented by 16 patients from the Hemophilia Unit of the Region of Murcia with diagnosis of severe Hemophilia A who were on prophylactic treatment with recombinant FVIII. Blood tests were performed before (72 h without FVIII, baseline sample) and after 15 minutes of FVIII infusion. As a control group, 15 healthy subjects were studied. Platelet aggregation was determined by: closure time (PFA-100¿), optical aggregation (Chronolog¿), impedance aggregation (Multiplate¿), and flow cytometry (FACSCanto II¿). We also studied the expression of platelet activation markers, such as p-selectin, CD63, platelet-leukocyte aggregates and platelet-factor tissue. The total number of microparticles (annexin V positive), platelet origin (CD61), with expression of p-selectin (CD62p) and endothelial origin (CD144) were analyzed by flow cytometry (Beckman Coulter Gallios¿). So, we used the standardized procedure with Megamix-Plus FSC (BioCytex) which contains fluorescent beads of varied diameters (0.1 / 0.3 / 0.5 / 0.9 ?m) to cover the range (0.1 to 1 ?m) of microparticles. Platelet cytosolic Ca2+ was also analyzed. Statistical analysis was performed using SPSS 20.0 software. In order to compare the quantitative variables, Student&apos;s t was used in case of normality and the Mann-Whitney or Wilcoxon U test in case of no normal distribution. Correlations were performed using the Pearson correlation test. Qualitative variables were analyzed using the Pearson Chi2 distribution test. The significance level used was ? <0.05. RESULTS AND CONCLUSIONS: In our study, we found no significant differences in platelet function in patients with severe HA in prophylactic treatment. Neither we observed affectation of platelet function in relation to the FVIII infusion. After the FVIII administration, patients presented less endotelial microparticles, so this treatment does not increase one of the possible markers of thrombotic risk in these patients. The total amount of plasma microparticles and the platelet microparticles were decreased in patients with HA compared to the control group. We do not consider indicated in the usual clinical practice the realization of platelet aggregation studies in patients with severe HA in prophylactic treatment.