Redes de señalización implicadas en la regulación del metabolismo de las ectoínas en la bacteria halófila Chromohalobacter salexigens y su potencial terapéutico como agente neuroprotector

Resum

Chromohalobacter salexigens es una bacteria halófila que produce naturalmente ectoína e hidroxiectoína, dos solutos compatibles biotecnológicamente importantes que se acumulan en respuesta al estrés osmótico y por calor, respectivamente. La explotación de C. salexigens en biotecnología como productor de ectoínas requiere una comprensión integral de las vías reguladoras que controlan el metabolismo de las ectoínas. La disponibilidad de su secuencia genómica, datos fisiológicos, bioquímicos, genéticos y transcriptómica de alto rendimiento, obtenidos previamente de nuestro Grupo de Investigación, junto con estudios regulatorios (este trabajo), nos permitirán obtener un conocimiento más global del metabolismo de las ectoínas. en C. salexigens. El objetivo de este doctorado fue doble. Por un lado, para conocer mejor los circuitos reguladores que controlan el metabolismo de las ectoínas en C. salexigens. Por otro, avanzar en el uso biomédico de la ectoína para la prevención y el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. Los hallazgos presentados en este trabajo proporcionan pistas para una mejor comprensión de la compleja regulación del metabolismo de la ectoína y la osmoadaptación en esta bacteria moderadamente halófila, y su contribución a la adaptación a ambientes extremos. Nuestros resultados se superpondrán al modelo metabólico existente de alta calidad basado en el genoma y los análisis globales, a fin de facilitar el diseño racional de nuevas cepas para la ingeniería metabólica de sistemas. Además, hemos investigado la aplicación in vitro e in vivo de ectoína como tratamiento neuroprotector y preventivo de la inflamación en un modelo murino Aβ de la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, tenemos más información sobre sus posibles aplicaciones en biomedicina, especialmente en trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer (EA). EupR es el primer regulador de respuesta descrito de un sistema de dos componentes involucrado en la osmorregulación bacteriana (Rodríguez-Moya et al., 2010). Mediante estudios in silico, se seleccionó EupK como su histidina quinasa afín putativa. Los análisis fenotípicos de mutantes eupR y eupK mostraron que tanto EupR como EupK participan en el control de los tres procesos dentro del metabolismo de las ectoínas, síntesis, degradación / reciclaje y captación, como un sistema clave que permite el ajuste fino de la concentración intracelular. de estos solutos. Sin embargo, la asociación entre EupK y EupR no pudo ser confirmada por estos análisis, ya que eupK no siempre reproducía el fenotipo eupR. Este hallazgo señaló la participación de HK y / o RR adicionales que participarían en el control del metabolismo de las ectoínas. Experimentos adicionales de interacción proteína-proteína in vivo y de fosfotransferencia demostraron no solo la interacción entre EupK y EupR, sino también la funcionalidad del sistema de dos componentes, ya que EupK fue capaz de fosforilar EupR. Como EupK es un HK híbrido que carece del dominio HPt involucrado en la fosfotransferencia durante los eventos de fosfotransferencia, se seleccionaron tres HK híbridos, Csal_1062, Csal_1635 y Csal_2667, como los candidatos más adecuados para formar parte de la red de señalización EupK / EupR al proporcionar este dominio de fosfotransferencia. . Nuestros resultados indican que EupK y EupR constituyen un sistema de dos componentes, que forman parte de una red de señalización compleja de tipo "muchos a uno" con los otros HK híbridos, donde EupR es fosforilado por todos ellos. Estos eventos de interferencia dentro del regulador de respuesta podrían desarrollarse mediante una fosforilación directa del dominio REC de EupR por los dominios HisKA de las histidina quinasas híbridas, o mediante un mecanismo de fosforilación que involucre dominios HPt adicionales, y podría depender de las condiciones ambientales. . Además, este circuito de regulación ramificado y / o cruzado sería capaz de detectar y responder tanto a estímulos de salinidad como de ectoína extracelular. Además, los experimentos transcriptómicos revelaron que la eliminación de eupR afectó a más del 18 y 22% de los genes de C. salexigens a baja y alta salinidad, respectivamente, distribuidos en las diferentes categorías funcionales descritas por el COG. Este resultado sugirió que EupR tiene un impacto global en la fisiología de C. salexigens. Entre ellos, 20 reguladores transcripcionales se expresaron diferencialmente en el mutante, lo que sugiere fuertemente que EupR es un regulador de reguladores y explica la gran cantidad de genes afectados por su deleción. La importancia de este regulador debe destacarse en la llamada "canalización de nitrógeno" que ocurre en C. salexigens (Pastor et al., 2013), al controlar el equilibrio entre la síntesis de proteínas, el metabolismo del nitrógeno y la síntesis de ectoína, posiblemente a través de la regulador de nitrógeno NtrC, entre otros. Otro de los procesos controlados por este regulador sería la quimiotaxis, que debería estar directamente relacionada con la osmodetección en C. salexigens, ya que la motilidad del flagelo es dependiente de Na + (Salvador et al., 2018). Este mecanismo regulador podría ejercerse mediante el control de otros sistemas de dos componentes como CheA y CheY. Por otro lado, la implicación de EupR en el metabolismo central fue notable, con 212 y 306 genes expresados diferencialmente a baja y alta salinidad, respectivamente. Entre ellos, cabe destacar los implicados en el metabolismo del carbono, al influir en el equilibrio de distribución de los diferentes flujos metabólicos: (i) asimilación de glucosa regulando la ruta periplásmica y citoplásmica de Entner-Doudoroff (ED); (ii) el metabolismo del nitrógeno y (iii) el metabolismo energético mediante el control de la fosforilación oxidativa, especialmente a alta salinidad. Finalmente, los resultados revelaron una fuerte influencia de EupR en la osmoadaptación de C. salexigens, donde EupR podría tener un papel en la regulación de la acumulación jerárquica de solutos compatibles, con el fin de asegurar la concentración intracelular adecuada de los diferentes solutos según las limitaciones ambientales, la fuente de carbono o la presencia de osmoprotectores en el medio externo, entre otros. Una conclusión final es que EupR cumpliría todos los criterios para postularse como un regulador global involucrado en el control del metabolismo de solutos compatibles, especialmente el de ectoínas, así como los procesos productores de energía y metabolismo central de C. salexigens. Por tanto, influiría en las adaptaciones metabólicas y fisiológicas de C. salexigens a la osmolaridad externa. Los resultados derivados de este trabajo contribuirán a dilucidar la compleja red reguladora involucrada en el control de la síntesis de ectoínas, que a su vez permitirá la construcción de un modelo regulador de señalización y transcripción para C. salexigens. Por otro lado, en este trabajo se evaluó la capacidad neuroprotectora in vitro e in vivo de la ectoína. Nuestros resultados demuestran la capacidad protectora de la ectoína frente al daño oxidativo, su actividad antioxidante en las células neuronales humanas, así como su capacidad para prevenir la formación de oligómeros ADDL responsables de la inflamación. Además, la ectoína logró atravesar la barrera hematoencefálica y llegar a zonas cerebrales donde se desarrolla la enfermedad de Alzheimer, como corteza o hipocampo, y permanecer con concentraciones farmacológicamente activas durante 48h. La administración intragástrica de ectoína durante 3 meses en ratones jóvenes transgénicos APP / PS1 (que desarrollan EA) mejoró su memoria y disminuyó la concentración de Aβ en el tejido cerebral. También se observó una disminución en el tamaño de las placas acompañada de un mayor reclutamiento de la microglía. Además, la inoculación intragástrica de ectoína condujo a concentraciones cerebrales similares a las alcanzadas con la administración intraperitoneal, dentro del rango de actividad observado in vitro, lo que sugiere que la administración oral de ectoína sería factible. Todos estos resultados apuntan a la ectoína como un candidato interesante para ser utilizado como fármaco para la prevención y el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.