Óptica adaptativa y compresión de pulsos en microscopía multifotónica. Aplicaciones en tejidos oculares

Resumen

Durante las dos últimas décadas las técnicas de microscopía multifotónica (o no lineal), entre ellas la fluorescencia a 2 fotones (TPEF, del inglés Two-Photon Excitacion Fluorescence) y la generación de segundo armónico (SHG, del inglés Second Harmonic Generation), se han convertido en potentes herramientas para la visualización de tejidos biológicas. Dichas técnicas permiten el registro de imágenes de capas profundas de las muestras debido a su confocalidad intrínseca. Sin embargo, las aberraciones del sistema óptico y del propio tejido limitan la calidad de la técnica. La calidad de las imágenes registradas se reduce progresivamente conforme los planos se sitúan más dentro de la muestra. La incorporación de óptica adaptativa permite la manipulación del frente de onda para minimizar el impacto de dichas aberraciones y restaurar la calidad de imágenes. Por otra parte, la dispersión óptica de los componentes del microscopio así como de la propia muestra, hacen que las componentes espectrales de los pulsos ultracortos utilizados viajen a diferentes velocidades. Esto se traduce en un ensanchamiento temporal de los pulsos que reduce la eficiencia de los procesos multifotónicos. Para compensar estos efectos de dispersión normalmente se utilizan los compresores de pulsos, capaces de modificar la fase de los diferentes componentes de frecuencia de los pulsos y comprimirlo temporalmente. En ese sentido la presente Tesis Doctoral se concentra en mejorar las imágenes de microscopia multifotónica mediante manipulaciones espaciales y temporales de un haz láser ultrarrápido ultraintenso por medio de la corrección de aberraciones y la compresión de pulsos, respectivamente. Para corregir el frente de onda se ha utilizado un modulador espacial de cristal líquido y un espejo deformable. Para optimizar las propiedades temporales de los pulsos de luz se ha empleado un compresor de pulsos variable. Se ha prestado especial atención a los efectos producidos en las imágenes multifotónicas de los tejidos oculares. Las principales conclusiones de este trabajo son las siguientes: 1. Se ha desarrollado un microscopio multifotónico que incluye un modulador espacial de cristal líquido en la vía de iluminación para corregir plano a plano las aberraciones inducidas por la muestra. El procedimiento experimental se basa en una técnica de óptica adaptativa sin sensor de frente de onda y un algoritmo tipo hill-climbing. A pesar de utilizar un objetivo en aire con baja apertura numérica y una configuración de microscopio en reflexión, el método es capaz de generar imágenes TPEF y SHG con calidad notablemente mayor. 2. Aunque la corrección de óptica adaptativa es particular para cada muestra, la cantidad de aberración aumenta linealmente con la profundidad. Por otra parte, el frente de onda que optimiza la imagen en una zona determinada no depende del área registrada. Sin embargo, esto puede depender de la estructura de la muestra y la profundidad del plano de interés. 3. La combinación de los modos de Zernike que optimiza la imagen multifotónica depende de la secuencia de control de la corrección. El algoritmo hill-climbing es eficiente para ambas direcciones creciente y decreciente. Aunque los mapas de aberración óptimos difieren entre ambas secuencias de control, las imágenes finales mejoradas son similares. 4. Se encontró que la aberración esférica es el término de aberración dominante, especialmente en los planos más profundos de las muestras. La contribución de este término de aberración es tal, que las imágenes que proporciona son de calidad similar a las obtenidas cuando se tiene en cuenta también otros términos como el coma y el astigmatismo. 5. Se ha utilizado un módulo de óptica adaptativa compuesto por un sensor de Hartmann-Shack y un espejo deformable para manipular el patrón de aberración esférica del haz láser incidente e incrementar la profundidad de foco. 6. Utilizando imágenes de tomografía rápida se determinó un patrón de aberración esférica único y óptimo que evita la corrección plano a plano. Un único valor de aberración esférica reduce la calidad de imagen de los planos más superficiales. Sin embargo las imágenes en las capas más profundas mejoran con respecto a las condiciones originales. 7. Para pre-compensar la dispersión de los pulsos láser producidos por la óptica del microscopio y la muestra se ha usado un compresor de pulsos variable. Esta operación aumenta la eficiencia de los procesos multifotónicos de forma que las señales TPEF y SHG aumentan un factor 2x o más. 8. El estado de compresión óptimo que proporciona la mejor imagen depende de la muestra, pero para cada una de ellas es constante con la profundidad. 9. Esta operación de compresión de pulsos permite la reducción de la potencia del láser de iluminación, lo que minimiza los posibles efectos secundarios no controlados de daño térmico o de foto-blanqueo (del inglés photo-bleaching). Esto es de vital importancia en muestras biológicas, más propensas a este tipo de daño. Los resultados muestran que la operación de compresión permite una reducción de la potencia de aproximadamente un 50%. During the last two decades multiphoton (or nonlinear) microscopy, including two photon excitation fluorescence (TPEF) and second harmonic generation (SHG), has become a powerful tool for visualization of biological tissue. Such techniques allow the registration of images of deeper layers of the samples due to their inherently confocality. However, aberrations in the optical system and the specimen-induced ones limit the quality of this technique. The quality of the recorded images is progressively reduced when imaging deeper layers within the sample. The implementation of adaptive optics techniques allows the manipulation of the wavefront to minimize the impact of those aberrations and restore the quality of the images. Furthermore, the optical dispersion of the microscope components and the sample itself also affect the imaging recording technique. Due to this, different frequency components of the ultrashort pulses travel at different speed through the optics of the microscope. This leads to a temporal broadening of the pulses, which reduces the efficiency of multiphoton processes. To compensate for these dispersion effects pulse compressors are usually used, which are able to modify the phase of the different frequency components of the pulse. In that sense, this Doctoral Thesis is focused on improving multiphoton microscopy images by spatial and temporal beam manipulations of the ultra-fast ultra-intense laser beam through the correction of aberrations and pulse compression, respectively. To correct the wavefront, both a liquid-crystal spatial light modulator and a deformable mirror were used. To optimize the temporal properties of the pulses, a variable pulse compressor has been employed. Particular attention has been paid to the effects on multiphoton images of ocular tissues. The main conclusions of this work are: 1. A custom-built MP microscope including an LCoS-SLM in the illumination pathway has been used to correct for plane-by-plane specimen-induced aberrations. A WFSL-AO technique based on a deterministic hill-climbing algorithm has been developed for this purpose. Despite using a low-NA air objective and a microscope configuration in backscattered mode, the procedure provided significant improved images at different depth locations for both TPEF and SHG signals. 2. Although the AO correction was particular for each sample and depth location, the amount of aberration linearly increased with depth. Moreover, the WA optimizing the MP image at a particular location was not dependent on the field-of-view. However, this may depend on the specimen structure and imaged depth location. 3. The combination of Zernike modes optimizing the MP image depended on the correction control sequence. The hill-climbing algorithm was effective for both increasing and decreasing directions. Despite the optimum WA maps differed, the final enhanced images were similar. 4. SA aberration was found to be the dominant aberration term, especially at deeper locations within the samples. The correction of this term itself provides improved MP images of similar quality to those including the correction of other terms such as coma and astigmatism. 5. An alternative AO module composed of a HS sensor and a DM mirror was used to manipulate the SA pattern of the incident beam in order to increase the DOF. 6. A unique SA pattern was determined via a fast tomographic imaging technique to avoid plane-by-plane correction. While controlled amounts of SA reduced the image quality of shallow planes, these also led to better images at deeper layers, independently of the specimen-induced aberrations. 7. A variable pulse compressor was used to pre-compensate the dispersion of the laser pulses produced by the microscope optics and the sample. This operation increased the effectiveness of the MP processes and then the total TPEF and SHG signal up to a factor larger than 2x. 8. The PCS providing the best image was particular for each sample but kept constant with depth location. 9. This pulse compensation operation also allowed reducing the laser power use for MP imaging and minimize photo-damage effects. This is extremely important in biological samples. Results show that the use of an optimum PCS permits a decrease of about 50% in laser power.