Caracterización funcional y molecular de nuevas variantes genéticas y desarrollo de una nueva aproximación de terapia génica en trastornos plaquetarios congénitos

Resumen

Introducción: Los Trastornos plaquetarios congénitos [TPC] son un grupo heterogéneo de enfermedades raras que afectan al recuento de plaquetas o a sus funciones. Su severidad clínica es variable, desde complicaciones insignificantes a potencialmente mortales. Su diagnóstico genético se ha visto facilitado en los últimos años con la introducción de la secuenciación masiva. Por el contrario, no ha habido grandes avances en su manejo clínico. Objetivo: Caracterizar una serie de pacientes con sospecha de padecer un TPC, identificar su patología molecular subyacente, y demostrar la patogenicidad de sus variantes moleculares. Adicionalmente, explorar el potencial de la terapia génica en los TPC clínicamente severos Metodología: Reclutamos pacientes con diátesis hemorrágica, disfunción plaquetaria y/o trombocitopenia en el proyecto multicéntrico de “Caracterización Funcional y Molecular de pacientes con TPC”. Re-evaluamos su historial clínico y antecedentes familiares, estudiamos el fenotipo plaquetario, y abordamos el diagnóstico genético mediante secuenciación masiva de un panel de genes prediseñado. Se evaluó la patogenicidad de las variantes candidatas identificadas en los enfermos, aplicando los criterios de ACMG, y realizando ensayos específicos. Aplicando la tecnología CRISPR/Cas9, generamos un modelo de células CD34+ con fenotipo de Trombastenia de Glanzmann [TG] (CD34+ TG-like). Diseñamos un vector viral como potencial terapia génica para la TG. Resultados: Hemos caracterizado funcional y molecularmente 50 pacientes de 14 familias no emparentadas. i) Demostramos que la diátesis hemorrágica en una niña está causada por la presencia en heterocigosis de la variante p.Asn143Ser en PTGS1 (ciclooxigenasa -1). Se demostró un patrón de disfunción plaquetaria aspirina-like, con defecto de agregación plaquetaria selectivo para ácido araquidónico y reducida capacidad de síntesis plaquetaria de TXA2. Estudios en plaquetas y en células 293THEK, demostraron que la mutación provoca la pérdida de un N-glicano generando una proteína hipoglicosilada con un efecto dominante negativo en la función. ii) Caracterizamos un pedigrí con macrotrombocitopenia tipo SRC-RT, con 7 portadores de la variante p.E527K en Src. Confirmamos un defecto de agregación, activación y secreción plaquetaria, más marcado, pero no exclusivo, para agonistas de GPVI; un defecto de marcadores -granulares mediante inmunfluorescencia en frotis sanguíneos; también la ganancia de función de esta mutación causando fosforilación constitutiva en tirosinas de proteínas plaquetarias incluyendo Src, PLCy2 y BTK. Evidenciamos que en estos pacientes coexisten complicaciones de tipo inmune y neurológico. Su respuesta plaquetaria a la esplenectomía y los esteroides, así como el aparente estado inflamatorio en algunos de ellos, sugiere cierta similitud clínica con la trombocitopenia inmune [PTI]. iii) Describimos la serie más larga, descrita hasta la fecha, de pacientes con TUBB1-RT (9 familias), identificando en ellos 6 variantes en TUBB1 (p.Cys12Leufs12*, p.Thr107Pro, p.Gln423*, p.Arg359Trp, p.Gly109Glu, and p.Gly269Asp). Se observó en ellas una penetrancia incompleta, con una mayoría de pacientes portadores con macrotrombocitopena, otros sin trombocitopenia pero con plaquetas grandes y una minoría de portadores con plaquetas normales. Encontramos en un pedigrí, por primera vez en TUBB1-RT, que la mutación responsable, p.Gly109Glu, causa enfermedad solo en homocigosis, poniendo de manifiesto la importancia de la carga alélica. Los estudios plaquetarios (expresión de GPs, agregación, activación y secreción, spreading) demostraron un escaso efecto de estas mutaciones en la funcionalidad plaquetaria, acorde con la moderada o ausente clínica hemorrágica en pacientes con TUBB1-RT. La expresión de estas mutaciones (solo las misssense) en células CHO demostró que afectan significativamente la expresión y localización de la tubulina-1. Los ensayos de cultivo in vitro de células CD34+ de los enfermos, demostraron que las mutaciones alteran la diferenciación/maduración de los Mks y la formación de proplaquetas. Los datos obtenidos en esta serie de familias y mutaciones de TUBB1, nos ha permitido reclasificar la patogenicidad de las variantes identificadas y definir criterios de patogenicidad ACGM adaptados a mutaciones en TUBB1. iv) La caracterización del fenotipo plaquetario (agregación, activación, cuantificación de gránulos por microscopia electrónica e inmunofluorescencia), los estudios de segregación familiar y, de forma muy novedosa, el análisis del transcriptoma plaquetario, apoyan fuertemente la patogenicidad de las variantes de RUNX1 p.Gln268* y p.Thr196Ala, pero no así de p.Asn159Ser. Hasta el 70% de los genes previamente descritos como diana de RUNX1, (incluyendo entre otros MYL9, MYH9, ALOX12, TREML1 e ITGA2), mostraron en nuestro microarray una expresión alterada en los portadores de las variantes p.Gln268* y p.Thr196Ala, en comparación con controles sanos. Estos datos se confirmaron, para algunos genes, mediante RT-qPCR. En el caso de p.Asn159Ser solo el 7% de los genes mostraron expresión alterada. Clasificamos los 120 genes más infraexpresados en 5 grupos: genes implicados en el citoesqueleto (18%); genes que participan en la transducción de señales (40%); genes relacionados con la interacción con ADN; genes implicados en el ciclo celular; genes asociados, al menos ocasionalmente, con procesos tumorales. También, encontramos un gran número de genes sobreexpresados, siendo el primero CA1, el gen que codifica la anhidrasa carbónica I (Fold change 140.04 vs. controles). Entre los sobreexpresados, hay genes que codifican proteínas de origen eritroide, transportadores de membrana, proteínas ribosomales y otras implicadas en la síntesis, modificación y degradación de proteínas y LXN, gen que codifica la latexina que es una proteína reconocida recientemente como supresor tumoral en neoplasias hematológicas. v) Desarrollamos un modelo celular con fenotipo de TG en el que demostramos la eficacia de un vector viral para revertir el fenotipo patológico. Conclusiones: Presentamos el diagnóstico clínico, funcional y molecular de un amplia número de pacientes con sospecha de TPC, caracterizando 11 variantes genéticas en 4 genes distintos. Reportamos el tercer caso de disfunción plaquetaria y sangrado asociado a patología molecular de PTGS1. Esta paciente revela la importancia de la N-glicosilación en la funcionalidad de la COX-1. Caracterizamos la cuarta familia con la mutación p.E527K y SRC-RT, que pone de manifiesto la coexistencia de alteraciones plaquetarias, inmunes y neurológicas en esta patología. La aparente parcial similitud con la PTI, podrían ayudar a establecer futuras estrategias de tratamiento. El estudio de la serie más larga descrita hasta la fecha de TUBB1-RT, revelan que la penetrancia incompleta es un fenómeno común en esta enfermedad, resalta la importancia de la carga alélica en la enfermedad, consolida el defecto de maduración de Mks, y el escaso efecto deletéreo de estas mutaciones en la reactividad plaquetaria, acorde con la moderada/ausente clínica hemorrágica en pacientes con TUBB1-RT. El análisis de trascriptoma plaquetario en tres casos con sospecha de RUNX1-RT, demuestran que puede ser una herramienta útil para establecer la patogenicidad de mutaciones nuevas de RUNX1, identificadas en pacientes con o sin historial familiar de neoplasia. Por último, demostramos la utilidad de la tecnología CRISPR/Cas9 para diseñar modelos de TPC, como la Trombastenia de Glanzmann. También mostramos la eficacia de un vector viral para revertir in vitro el fenotipo de la TG. Estos datos pre-clínicos son un importante avance en el camino hacia el potencial uso clínico de la terapia génica como alternativa curativa en TPC graves.