Identificación y estudio funcional de una proteína de choque térmico implicada en el mecanismo no canónico de silenciamiento génico de Mucor lusitanicus

Resum

El silenciamiento génico fue descubierto en plantas en 1990. Posteriormente se observó su presencia en animales y en hongos. Desde entonces el silenciamiento génico se ha convertido en el protagonista de numerosos estudios científicos, generando la diversidad de rutas de silenciamiento génico existentes en la naturaleza un enorme interés. Las moléculas de RNA de doble cadena son las encargadas de desencadenar el mecanismo de silenciamiento génico o RNAi (interferencia de RNA), pudiendo tener un origen endógeno o exógeno. Este mecanismo es el encargado de reconocer los RNA diana complementarios a las cadenas guía generadas a partir del RNA de doble cadena. De este modo, la maquinaria de silenciamiento es capaz de degradar esos RNA diana. En Mucor lusitanicus existen dos rutas de silenciamiento, una ruta canónica y una ruta no canónica llamada NCRIP. R3B2 es la ribonucleasa protagonista de esta última, siendo una proteína con características poco comunes en la naturaleza, presente en Mucorales y que degrada RNA de una cadena. En este trabajo se ha identificado el interactoma de R3B2, que podría incluir a proteínas participantes en la ruta NCRIP. Realizando un ensayo de doble híbrido con una genoteca de cDNA, obtenida a partir del transcriptoma de M. lusitanicus, se identificó a una proteína Hsp70 que interacciona con R3B2. Esta proteína de choque térmico pertenece a la subfamilia más atípica de Hsp70, las HspA12. Esta familia presenta grandes diferencias a nivel de dominios con las demás familias de Hsp70 y, a partir de análisis filogenéticos, se ha observado la conservación y la expansión que se han producido de estas en determinadas especies, como M. lusitanicus. Además de identificar las regiones responsables de esta interacción, también se ha comprobado, mediante un ensayo de doble híbrido en levadura, que HspA12a no interacciona con otras proteínas del silenciamiento génico de M. lusitanicus. Se generaron mutantes carentes del gen hspA12a mediante recombinación homóloga. Estos mutantes crecían de manera deficiente a una temperatura de 30 ºC, 4 ºC por encima de su temperatura óptima de crecimiento (26 ºC), aunque un pequeño porcentaje de individuos (inferior al 1 %) era capaz de crecer a esa temperatura. Estos individuos transmitían esta capacidad de supervivencia a un 30 % de sus esporas. Este fenotipo de supervivencia desaparecía tras varios pases a 26 ºC, lo que hace pensar en una regulación de tipo epigenético. Durante estos ensayos aparecieron dos individuos capaces de crecer a 30 ºC de forma permanente, a los que se secuenció el genoma y se realizó una búsqueda de variantes génicas, encontrando varios candidatos causantes de ese crecimiento. Se ha comprobado que la expresión del gen hspA12a depende de la temperatura y aumenta cuando esta lo hace. Para comprobar si HspA12a está implicada en la ruta NCRIP, se analizó la expresión de genes regulados por esta ruta, mostrándose una participación esencial a 30 ºC, pero no a 26 ºC. Las pruebas realizadas indican que este gen no parece participar en la ruta canónica del silenciamiento, y que la región de HspA12a responsable de la interacción con R3B2 no afecta por si sola a la actividad ribonucleasa de R3B2. Los ensayos de virulencia en ratón, los mutantes en el gen hspA12a mostraron diferencias con el control virulento, con resultados más cercanos a los obtenidos para la estirpe avirulenta. A modo de conclusión, se ha identificado una nueva proteína del silenciamiento génico de M. lusitanicus que podría actuar estabilizando a la proteína R3B2 en condiciones de estrés, relacionada con la resistencia a altas temperaturas y que podría estar involucrada en la capacidad virulenta de este hongo.