Estudio de la degeneración de los fotorreceptores, epitelio pigmentario de la retina y de la reacción microglial en un modelo de fototoxicidad focal con led y neuroprotección en roedor

Resumen

Objetivos Los objetivos generales de esta tesis son los siguientes: 1. Estudiar “in vivo” en la rata albina adulta el curso temporal de la lesión focal fototóxica en la retina y caracterizar “ex vivo” la reacción microglial en la capa de los segmentos externos de los fotorreceptores (SEF). 2. Caracterizar en la retina del ratón pigmentado adulto la degeneración de los fotorreceptores en un nuevo modelo de fototoxicidad focal con LED (FFL). 3. Estudiar la supervivencia de cono, la reacción microglial asociada y el epitelio pigmentario de la retina tras la fotoexposición focal con LED en ratones pigmentados tratados con bFGF y minociclina administrada de forma aislada o combinada. Material y métodos Para la realización de los experimentos se utilizaron ratas albinas adultas hembras y ratones pigmentados adultos hembras. Las manipulaciones de los animales se realizaron siguiendo la normativa europea (Directiva 2010/63/UE) y nacional (RD 53/2013) vigente sobre la protección de los animales utilizados para la experimentación y otros fines científicos. Para el estudio “in vivo” del curso temporal de la lesión focal fototóxica las retinas se examinaron mediante tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) a las 24 horas, a los 3, 5, 7, 14, 30 días de la fotoexposición focal con LED (FFL). Para caracterizar “ex vivo” la reacción microglial en la capa de los segmentos externos de los fotorreceptores (SEF) en la rata albina adulta, las retinas de los animales fueron inmunodetectadas con dos anticuerpos, anti-OPN1SW para la detección de los conos S y anti-Iba-1 para la detección de células de la microglía. Para el estudio de la cuantificación de los conos arrestina+ y su distribución en la retina del ratón pigmentado las retinas a plano y las secciones transversales se inmunodetectaron mediante un anticuerpo anti-arrestina, anti-OPN1SW y anti-opsina-L. Para el estudio “in vivo” de la lesión producida por la FFL los ratones pigmentados fueron estudiados mediante SD-OCT a 1, 3, 5 y 7 días de la FFL. Para el análisis “ex vivo” de la degeneración de los conos tras FFL se establecieron 4 grupos de animales de 6 ratones cada uno que fueron analizados a 1, 3, 5 y 7 días tras la FLL y se inmunodetectaron los conos mediante un anticuerpo frente a arrestina. Para el estudio de supervivencia de conos, la reacción microglial asociada y del epitelio pigmentario de la retina (EPR) tras la fotoexposición focal LED en ratones pigmentados tratados con bFGF y minociclina administrada de forma aislada o combinada, las retinas de los animales fueron estudiados mediante SD-OCT e inmunohistoquímica a 3 y 7 días tras la FFL. Para el estudio mediante inmunohistoquímica se utilizaron los anticuerpos anti-arrestina para el estudio de conos, anti-Iba1 para el marcaje de la microglía y anti-ZO-1 para el estudio del EPR. Para el análisis estadístico se utilizó One Way ANOVA o Kruskal Wallis para la comparación de más de dos grupos y t-test para la comparación de dos grupos. Resultados El estudio “in vivo” mediante SD-OCT de la evolución del daño retiniano tras una FFL en la retina de la rata albina mostró una lesión redondeada localizada en el cuadrante superotemporal de la retina en la que se observó una atrofia progresiva de la retina circunscrita a esta lesión. El espesor medio total de los ojos derechos fue de 192,3 ± 3,8 µm mientras que el espesor de la retina externa fue de 104,7 ± 3,9 µm. A los 30 días de la FFL, el espesor de la retina total disminuyó hasta 102,8 ± 17,2 µm y el de la retina externa disminuyó hasta 10,2 ± 5,7 µm El análisis de la supervivencia de los segmentos externos de los conos S (SES+) en el área de la lesion en la retina de la rata albina adulta mostró un número total de SES+ de 2398 ± 388. Al día de la FFL, el número de SES+ en el ACC descendió significativamente a 1369 ± 364. A los 3 días el número SES+ se mantuvo para posteriormente disminuir progresivamente hasta los 14 días de la FFL, cuando el número de SES+ decayó un 85% en área de la leison y se mantuvo constante hasta los 30 días de la FFL. Tras la FFL, se observó la aparición de células Iba-1+ circunscritas al centro del área lesionada a las 24 horas de la FFL que se mantuvo hasta los 30 días de la FFL. La morfología de estas células cambió en los diferentes intervalos de estudio. El estudio de la cuantificación y distribución de los conos arrestina+ (SEa+) en la retina del ratón pigmentado mostró que el número total de SEa+ fue de 141.842 ± 11.288 (n=10). Estos presentaban un gradiente dorso-ventral creciente y alta densidad en la retina central frente a la periferia. El número de conos L (SEL+) y S (SES+) fue menor (131.172 ± 8.945 y 111.158 ± 9.805). El estudio de los cortes transversales de la retina mostró que el 99% de los conos L expresaban también arrestina, mientras que el 92% de los conos arrestina+ expresaban también opsina S. El estudio “in vivo” mediante SD-OCT tras una FFL en la retina del ratón pigmentado mostró una lesión en el cuadrante temporal superior de la retina. El espesor medio de la retina total de la retina del ratón pigmentado en los ojos derechos controles fue de 205,05 ± 4,2 µm (n=6), mientras que el espesor medio de la retina externa fue de 116,5 ± 2,88 µm. En el área de la lesión se observó una atrofia progresiva de la retina total hasta los 5 días de la FFL, cuando el espesor medio de la retina total fue de 127,15 ± 4,47 µm y se mantuvo constante hasta los 7 días de la FFL. El análisis “ex vivo” de la degeneración de los conos arrestina+ en el área de la lesión tras la FFL mostró una lesión circular en el cuadrante temporal superior cuya distancia al nervio óptico fue de aproximadamente 1 mm. El número de SEa+ de los ojos derechos controles en el área de la lesión fue de 6218 ± 341. El análisis de la degeneración de los SEa+ en la zona de la lesión reveló una degeneración progresiva de los SEa+ que fue significativa a los 3 días de la FFL (5516 ± 183) y continuó hasta los 7 días de la FFL cuando el número de SEa+ fue de 3966 ± 311. El estudio “in vivo” del espesor retiniano en el área de la lesión tras FFL y la administración de bFGF y minociclina de forma aislada o en combinación mostró que aquellas retinas tratadas con bFGF de forma aislada o en combinación presentaron una ralentización de la atrofia de la retina, a expensas de las capas externas, a los 5 días de la FFL en relación a las retinas tratadas con vehículos). Este efecto desapareció a los 7 días de la FFL. El estudio mediante inmunofluorescencia de la supervivencia de conos arrestina+ en las retinas tratadas con bFGF y minociclina de forma aislada o combinada reveló un efecto neuroprotector en el número de SEa+ del grupo tratado con bFGF y bFGF+minociclina a los 7 días de la FFL frente a sus vehículos. En el área de la lesión la microglía localizada en la capa plexiforme externa (CPE) reveló que aquellas retinas tratadas con terapias intravítreas presentaban entre 22-40% más de células de la microglía en el área de la lesión que aquellas que fueron tratadas con terapias intraperitoneales o retinas derechas controles. Sin embargo, las retinas tratadas con bFGF+minociclina presentaron un menor número de células de microglía en la CPE a los 7 días de la FFL. El análisis cualitativo de las células Iba-1+ en la capa de los segmentos externos de los fotorreceptores (SEF) localizadas en el área de la lesión tras la FFL reveló que en las retinas derechas controles la presencia de estas células es anecdótica. Sin embargo, tras la FFL se observó la aparición de células Iba-1+ en el área de la lesión cuya morfología fue distinta a los 3 días de la FFL, presentando un morfotipo más redondeado o ameboide que a los 7 días de la FFL cuando la morfología era más alargada. En las retinas tratadas con minociclina la presencia de estas células en la capa SEF fue menor que en aquellas tratadas con otras terapias. El estudio del EPR mostró que tras la FFL se produce una degeneración progresiva de las células del EPR, con disminución del número de células contenidas en el área de la lesión y alteraciones de su morfología. Los epitelios controles derechos mostraron un número de células del EPR en el área de 10.000 µm2 de estudio de 24,3 ± 3 células con un área media celular de 353,4 ± 124,4 µm2 (n=6). A los 7 días, el número de células del EPR decayó en torno a un 47% y se produjo un aumento del área media celular de los EPR. A los 3 días de la FFL, las retinas tratadas con bFGF y bFGF+minociclina conservaron el área media celular, Sin embargo, las terapias de bFGF y bFGF+minociclina no produjeron diferencias significativas en el número de células del EPR a los 3 y 7 días de la FFL