Estudio de la respuesta glial y de las células ganglionares intrínsecamente fotosensibles en dos modelos animales de degeneración hereditaria de fotorreceptores y tras inyecciones intravítreas

Resumen

Objetivos Estudiar el curso temporal de muerte de los fotorreceptores y la respuesta de las células de macro y microglia en el inicio de la degeneración de la retina, en dos modelos animales de degeneración hereditaria de los fotorreceptores con diferentes mecanismos: la rata P23H-1 y la rata Royal College of Surgeons (RCS). Estudiar la población de células ganglionares de la retina intrínsecamente sensibles a la luz que expresan melanopsina (mCGRs) en uno de los modelos de degeneración hereditaria de fotorreceptores: la rata P23H-1. Investigar la respuesta de las células de macro y microglia de la retina de la rata adulta tras una o varias inyecciones intravítreas (IIV). Material y métodos. Para estudiar la evolución de la degeneración de la retina se utilizaron dos modelos de degeneración hereditaria de los fotorreceptores con paradigmas diferentes, la rata P23H-1 y la RCS, y como controles sanos la rata Sprague Dawley (SD) y la Pieval Virol Glaxo (PVG), respectivamente. Los animales fueron procesados entre los 10 y 60 días de edad y se realizaron secciones transversales en criostato de sus retinas. Las secciones fueron inmunodetectadas con anticuerpos contra; i) rodopsina para detectar los segmentos externos de los bastones, ii) Opsinas L/M y S para detectar los segmentos externos de los conos, iii) molécula ionizadora adaptadora de enlace de calcio1 (Iba1) para detectar las células de microglia, iv) proteína ácida fibrilar glial (GFAP) para detectar las células de macroglia , v) antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) para detectar células en división celular, vi) isolectina B4 (IB4) para detectar las células de microglia y vasos sanguíneos. Además, se cuantificaron las filas de núcleos de los fotorreceptores en la capa nuclear externa y las células de microglía en todas las capas de la retina. Para estudiar la población de mCGRs en las ratas P23H-1 y P23H-3 se utilizaron animales con 30, 365 y 540 días de edad y como control se utilizaron ratas SD con la misma edad. Tras diseccionar y montar a plano las retinas, éstas se inmunodetectaron con anticuerpos contra melanopsina y/o Brn3a para detectar la población de mCGR y la población general de células ganglionares de la retina (CGR), respectivamente. Finalmente, se cuantificaron dichas poblaciones y se representó gráficamente su distribución en la retina mediante el uso de mapas de isodensidad para las CGRs y mapas de vecinos para las mCGRs. Además, de estas últimas se analizó su arborización dendrítica. Para investigar la respuesta de las células de macro y microglia tras una o varias IIV se utilizaron ratas hembra adultas SD. Estas recibieron una o tres IIV (una cada 7 días) de anticuerpo anti VEGF derata (5 ?l, 0,015 ?g / ?l), triamcinolona (2,5 o 5 ?l, 40 ?g / ?L, Trigón Depot), bevacizumab (5 ?L y 25 ?g / µL, Avastin), o sus vehículos (PBS y solución salina equilibrada (BSS)). Las retinas se analizaron 7 días después de la última inyección, se montaron a plano y se incubaron con anticuerpos contra: i) Iba1, ii) GFAP y iii) vimentina (marcador específico de las células de Müller). Las células de macro y microglia fueron analizadas cualitativamente, además las células de microglia fueron analizadas cuantitativamente mediante un método semiautomático. En todos los estudios las retinas fueron examinadas con un microscopio de fluorescencia. En el estudio de las IIV también se utilizó además microscopía confocal. Resultados. Al analizar las retinas en los animales con degeneración retiniana, se observó que la degeneración de los fotorreceptores comenzaba antes y progresaba más rápidamente en las ratas P23H-1 que en las ratas RCS. Sin embargo, en ambos modelos de degeneración, la activación de las células de microglía ocurría simultáneamente a la muerte de los fotorreceptores; mientras que la sobreexpresión de GFAP en los astrocitos y células de Müller, comenzaba más tarde y con mayor intensida en estas últimas. A medida que progresaba la degeneración, en contraste con los animales sanos, encontramos células microgliales en las capas nuclear externa y de los segmentos externos de los fotorreceptores. Además, el número de células microgliales aumentó en la totalidad de la retina, pero disminuyendo en la retina interna y aumentando en la retina externa. Tanto el número total de células de microglia como la migración de las mismas desde las capas internas hacia las externas fue mayor en las ratas RCS. El mayor número de células microgliales en las retinas degeneradas no se puede explicar solamente con la migración intrarretiniana y además la inmunodeteccion de PCNA reveló proliferación microglial en ambos modelos, aunque más importantemente en las ratas RCS. Cuando se analizó la población de mRGCs y de CGRs en las ratas P23H-1 jovenes comparadas con los animales controles se observó una disminución significativa en las CGRs que expresan Brn3a, pero no de mRGCs. Sin embargo, en las ratas P23H-1 adultas se observó una disminución del número de mRGCs y de CGRs de un 22.6% y un 28,2% a los 365 y 540 días de edad, respectivamente. Además, con el tiempo se observó una disminución en los parámetros de arborización dendrítica de las mRGCs tanto en las ratas P23H-1 como en las ratas P23H-3 (cepa en la que la degeneración de la retina es más lenta). Al analizar la coexpresión de Brn3a y melanopsina en las ratas P23H-1 se encontró un porcentaje significativamente superior de coexpresión de ambos marcadores ya a 30 días de edad (3.31%) con respecto a los animales control (0.27%), además, este porcentaje de coexpresión aumentaba con la edad en las ratas P23H-1 (10,65% a 540 días de edad). Estos cambios celulares y de expresión se observaron solamente en los animales con degeneración hereditaria de los fotorreceptores (P23H-1), ya que en las ratas SD no se observó ningún cambio en la población general de CGR, ni en las población de mRGCs, ni en el porcentaje que mostró coexpresión (0.27%). Finalmente, en las retinas tratadas con las IIV se encontró en la zona de la inyección y a lo largo de toda la retina una importante respuesta de las células de macro y microglia, sin importar la sustancia inyectada; y esta respuesta fue mayor en las retinas que habían recibido varias inyecciones. También se observó una leve respuesta de las células de microglia tras las IIV en las retinas contalaterales que no habían sido inyectadas. Cuando se inyectó el anticuerpo humanizado bevacizumab, este causó una reacción/respuesta microglial tan fuerte que no se pudieron cuantificar las células de microglia. Al analizar la respuesta de las células de macroglia a las IIV se observaron dos tipos de respuesta: hipertrofia astrocítica e hipertrofia de los pies de las células de Müller. La hipertrofia de los astrocitos se observó en toda la superficie de las retinas inyectadas, mientras que la hipertrofia de los pies de las células de Müller sólo se observó en zonas bien definidas de la retina tras las inyecciones de triamcinolona y/o tras inyecciones repetidas. Conclusiones. En las degeneraciones hereditarias de los fotorreceptores la degeneración de la retina tiene un patrón diferente dependiendo del mecanismo etiopatogenico. En los dos modelos estudiados, la activación y migración de las células de microglia es simultánea a la muerte de los fotorreceptores, mientras que la respuesta de las células de macroglia es más tardía. La respuesta de la microglia no se puede explicar solamente en base a la muerte de los fotorreceptores ya que en los dos modelos existe una muerte severa de los fotorreceptores pero la respuesta de la microglia es mayor en las ratas RCS. Por lo tanto, en las ratas RCS la inflamación retininana es mayor y probablemente respondería mejor a un tratamiento antinflamatorio dirigido a la inhibición de las células de microglia. Tras la degeneración de los fotorreceptores hay una perdida secundaria de la población general de CGRs y de mCGRs. Las mCGRs supervivientes mostraron parámetros de arborización dendrítica disminuidos y aumento de la coexpresión de Brn3a y melanopsina. Estos cambios fenotípicos y moleculares pueden representar un esfuerzo de las mCGRs capaces de expresar Brn3a para resistir a la degeneración y / o supervivencia preferencial de las mCGRs. Las inyecciones intravítreas causan una respuesta en las células de macro y microglia que varía dependiendo de las sustancias inyectadas y del número de inyecciones. A mayor número de inyecciones mayor respuesta. Además la respuesta inflamatoria de la glía puede influir en los efectos de las sustancias inyectadas en la retina.